Aplicarea Microscopiei cu fluorescență cu reflexie internă totală cu fluorescență
TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope), microscop cu fluorescență cu reflexie internă totală, când lumina pătrunde într-un mediu cu indice de refracție mai mic dintr-un mediu cu indice de refracție ridicat, dacă unghiul de incident este suficient de mare, toată lumina este reflectată fără refracție, dar în Interfața celor două medii produce unde evanescente care pot excita fluorescența la 100 nm în apropierea interfeței pentru a realiza observarea suprafeței obiectului. Lumina de excitație poate fi trimisă prin iluminatorul unui microscop cu fluorescență convențional sau printr-un iluminator special, iar unghiul de incidente al laserului poate fi controlat. Metoda de excitație instantanee a câmpului este utilizată pentru a preveni intrarea luminii de excitație în detector. Lumina de excitație de la interfața dintre sticlă și apă produce un interior complet implementat prin reflexie. Datorită atenuării exponențiale a luminii de excitație, numai zona eșantionului foarte aproape de suprafața totală de reflexie va produce reflexie fluorescentă, ceea ce reduce foarte mult interferența zgomotului luminii de fundal la ținta de observare, astfel încât această tehnologie este utilizată pe scară largă în observarea dinamică. a substanțelor de suprafață celulară.
Diagrama schematică a microscopiei cu fluorescență cu reflexie internă totală (TIRFM)
①Eșantion ②Interval de unde evanescente ③Sticlă de acoperire ④Imersie în ulei ⑤Țintă ⑥Fascicul de emisie (semnal) ⑦Fascicul de excitație
Pentru a obține o reflexie internă totală, este necesar un unghi de incident mare, de exemplu, unghiul de incident la interfața sticlă-apă este mai mare de 61 de grade. Acest lucru poate fi realizat printr-o prismă, numită TIRFM bazat pe prisme, sau printr-o lentilă obiectiv cu o deschidere numerică mare, care se numește TIRFM de tip obiectiv. Microscoapele cu fluorescență cu reflexie internă totală comercializate în prezent sunt în general de tip lentilă obiectiv, cu viteză mare și precizie ridicată.
Microscopia cu fluorescență cu reflexie internă totală este utilizată pe scară largă în unele domenii biologice, deoarece poate realiza observarea fluorescenței într-un interval foarte subțire (mai puțin de 100 nm) pe suprafața obiectelor. Cum ar fi următoarele aplicații:
Observarea imaginilor suprafeței celulare: structura suprafeței membranei celulare, contactul cu suprafața celulară, dinamica suprafeței membranei/localizarea proteinelor.
Observarea și manipularea unei molecule unice: ATP marcat miozină, actină și Cy3-.
Mișcarea suprafeței membranei celulare: cum ar fi înghițirea veziculelor, expirația veziculelor și veziculele exocrine. cel
Observarea fenomenului de spargere a calciului în membrana celulară, monitorizarea canalelor ionice.
Cercetare motrice moleculară: motoare de rotație, proteine citoscheletice, polimeri, proteine G, proteine inel, motoare nucleotidice.
Pe lângă domeniul biologiei, are și aplicații bune în domeniul chimiei pentru observarea structurilor moleculare chimice.
