De ce trebuie să folosesc un microscop confocal?
1. Microscopul optic a fost perfecționat prin eforturile și îmbunătățirile marilor noștri predecesori. De fapt, microscopul obișnuit ne poate oferi cu ușurință și rapid imagini microscopice frumoase. Totuși, evenimentul care a revoluționat lumea microscoapelor aproape perfecte a fost inventarea „microscopului confocal cu scanare laser”. Acest nou tip de microscop se caracterizează printr-un sistem optic care extrage informații despre imagine doar de pe suprafața pe care este concentrat focalizarea, iar prin schimbarea focalizării în timp ce recuperează informațiile dobândite în memoria imaginii, este posibilă obținerea unei imagini clare cu informații 3-dimensionale complete. În acest fel, se pot obține cu ușurință informații despre forma suprafeței care nu pot fi confirmate cu un microscop convențional. În plus, în timp ce „creșterea rezoluției” și „aprofundarea adâncimii de focalizare” sunt condiții conflictuale pentru microscoapele optice convenționale, în special la mărire mare, această problemă este rezolvată cu microscoapele confocale.
2. Avantajele sistemului optic confocal
Schema schematică a microscopului confocal laser
Sistemul optic confocal este o iluminare punctuală a probei, în timp ce lumina reflectată este primită și folosind un receptor punctual. Când proba este plasată la punctul focal, aproape toată lumina reflectată ajunge la fotoreceptor, iar când proba este defocalizată, lumina reflectată nu poate ajunge la fotoreceptor. Cu alte cuvinte, într-un sistem optic confocal, este scoasă numai imaginea care coincide cu punctul focal, iar punctele și lumina împrăștiată inutilă sunt blocate.
3. De ce să folosiți un laser?
Într-un sistem optic confocal, proba este iluminată într-un punct, iar lumina reflectată este recepționată de un senzor punctual. Prin urmare, este necesară o sursă de lumină punctuală. Laserele sunt o sursă de lumină punctuală. În majoritatea cazurilor, sursa de lumină pentru microscoapele confocale este o sursă de lumină laser. În plus, monocromaticitatea, direcționalitatea și forma excelentă a fasciculului lasere sunt motive importante pentru adoptarea lor pe scară largă.
4. Este posibilă observarea în timp real bazată pe scanare de mare viteză.
Pentru scanarea laser, se folosește o unitate de deflexie optică acustică (Acoustic Optical Deflector, AO prime) în direcția orizontală, iar o oglindă de scanare cu fascicul controlat servo-electronic (Servo Galvano-mirror) este utilizată în direcția verticală. Deoarece nu există vibrații mecanice în deflectorul AO, este posibilă scanarea de mare viteză și este posibilă observarea în timp real pe ecranul monitorului. Viteza mare a acestei camere este un element foarte important care afectează direct viteza de focalizare și de regăsire a poziției.
5. Relația dintre poziția de focalizare și luminozitate
Într-un sistem optic confocal, proba este plasată corect în poziția focală atunci când luminozitatea este zui mare, în fața și în spatele acestuia, luminozitatea sa va fi redusă brusc (Figura 4 linia continuă). Această selectivitate sensibilă a planului focal este principiul din spatele orientării pe înălțime a microscopului confocal și al expansiunii adâncimii focalizării. În schimb, microscoapele optice obișnuite nu prezintă nicio modificare semnificativă a luminozității înainte și după poziția focală (linia punctată în Fig. 4).
6. Contrast ridicat, rezoluție înaltă
Într-un microscop optic convențional, lumina reflectată din porțiunea nefocalizată a microscopului interferează și se suprapune cu porțiunea de imagine focală a microscopului, rezultând o scădere a contrastului imaginii. În schimb, într-un sistem optic confocal, lumina împrăștiată în afara punctului focal și în interiorul lentilei obiectivului este aproape complet eliminată, rezultând imagini cu contrast foarte ridicat. În plus, puterea de rezoluție a microscopului este îmbunătățită deoarece lumina trece prin lentila obiectivului de două ori, clarificând imaginea punctuală.
7. Funcția de localizare optică
În sistemul optic confocal, lumina reflectată este protejată de micro-apertura în alt punct decât punctul focal. Ca urmare, atunci când se observă o probă tridimensională, imaginea se formează ca și cum proba ar fi fost tăiată cu punctul focal (Fig. 5). Acest efect se numește localizare optică și este una dintre caracteristicile sistemelor optice confocale.
