Care este scopul unui microscop confocal?
1. După eforturile și îmbunătățirile marilor noștri predecesori, microscopul optic a ajuns la punctul de perfecțiune. De fapt, microscoapele obișnuite ne pot oferi imagini microscopice frumoase simplu și rapid. Cu toate acestea, a avut loc un eveniment care a adus inovații revoluționare în această lume aproape perfectă a microscopului, care este invenția „microscopului confocal cu scanare laser”. Caracteristica acestui nou tip de microscop este că adoptă un sistem optic care extrage doar informații despre imagine de pe suprafața unde este concentrat focalizarea și restabilește informațiile obținute în memoria imaginii în timp ce schimbă focalizarea, astfel încât informațiile 3D complete să poată fi obținut. O imagine dură a inteligenței. Cu această metodă, este posibil să obțineți cu ușurință informații despre forma suprafeței care nu pot fi confirmate cu un microscop normal. În plus, pentru microscoapele optice obișnuite, „creșterea rezoluției” și „aprofundarea adâncimii de focalizare” sunt condiții contradictorii, în special la măriri mari, această contradicție este mai proeminentă, dar în ceea ce privește microscoapele confocale, această problemă este ușor de rezolvat.
2. Avantajele sistemului optic confocal
Schema schematică a microscopului confocal laser
Sistemul optic confocal realizează iluminarea punctuală a probei, iar lumina reflectată este recepționată și de receptorul punctual. Când proba este plasată în poziția de focalizare, aproape toată lumina reflectată poate ajunge la fotoreceptor, iar când proba este defocalizată, lumina reflectată nu poate ajunge la fotoreceptor. Adică, în sistemul optic confocal, va fi scoasă numai imaginea care coincide cu punctul focal, iar punctele de lumină și lumina împrăștiată inutilă vor fi ecranate.
3. De ce să folosiți laserul?
În sistemul optic confocal, proba este iluminată într-un punct, iar lumina reflectată este primită și de un fotoreceptor punctual. Prin urmare, o sursă de lumină punctuală devine necesară. Laserele sunt surse de lumină foarte punctuale. În majoritatea cazurilor, sursele de lumină laser sunt folosite ca surse de lumină pentru microscoapele confocale. În plus, caracteristicile de monocromaticitate, direcționalitate și forma excelentă a fasciculului laser sunt, de asemenea, motive importante pentru adoptarea sa pe scară largă.
4. Observarea în timp real bazată pe scanarea de mare viteză devine posibilă
Pentru scanarea laser, unitatea de deflexie optică activată acustic (Acoustic Optical Deflector, element AO) este utilizată în direcția orizontală, iar Servo Galvano-oglindă este utilizată în direcția verticală. Deoarece unitatea de deviere acusto-optică nu are o parte mecanică de vibrație, poate efectua scanare de mare viteză și este posibilă observarea în timp real pe ecranul monitorului. Această imagine de mare viteză este un element foarte important care afectează direct viteza de focalizare și de regăsire a poziției.
5. Relația dintre poziția focalizării și luminozitate
În sistemul optic confocal, luminozitatea probei este maximă atunci când proba este plasată corect în poziția focală, iar luminozitatea acesteia va scădea brusc înainte și după aceasta (linia continuă din Figura 4). Selectivitatea sensibilă a planului focal este, de asemenea, principiul determinării direcției înălțimii microscopului confocal și extinderii adâncimii focale. În schimb, microscoapele optice obișnuite nu au modificări semnificative de luminozitate înainte și după poziția de focalizare.
6. Contrast ridicat, rezoluție mare
În microscoapele optice obișnuite, din cauza interferenței luminii reflectate din partea de focalizare, aceasta se suprapune cu partea de focalizare a imaginii, rezultând o scădere a contrastului imaginii. Pe de altă parte, în sistemul optic confocal, lumina împrăștiată în afara punctului focal și lumina împrăștiată din interiorul lentilei obiectiv sunt aproape complet eliminate, astfel încât se poate obține o imagine cu contrast foarte mare. În plus, deoarece lumina trece prin lentila obiectivului de două ori, imaginea punctuală este mai întâi ascuțită, ceea ce îmbunătățește și puterea de rezoluție a microscopului.
7. Funcția de localizare optică
În sistemul optic confocal, lumina reflectată, alta decât punctul care coincide cu punctul focal, este ecranată de micropor. Prin urmare, atunci când se observă o probă tridimensională, se formează o imagine ca și cum proba ar fi tăiată cu planul focal (Figura 5). Acest efect este cunoscut sub numele de localizare optică și este una dintre specialitățile sistemelor optice confocale.
8. Focalizează funcția de memorie mobilă
Așa-numita lumină reflectată în afara punctului focal este protejată de micropori. Pe de altă parte, se poate considera că toate punctele de pe imaginea formată de sistemul optic confocal coincid cu punctul focal. Prin urmare, dacă proba tridimensională este deplasată de-a lungul axei Z (axa optică), imaginile sunt acumulate și stocate în memorie, iar în final se va obține imaginea formată din întregul eșantion și punctul focal. Funcția de aprofundare infinită a adâncimii de focalizare în acest fel se numește funcția memoriei mobile.
9. Funcția de măsurare a formei suprafeței
În ceea ce privește funcția de schimbare a focalizării, forma suprafeței probei poate fi măsurată fără contact prin adăugarea unui circuit de înregistrare a înălțimii suprafeței. Pe baza acestei funcții, este posibil să se înregistreze coordonatele axei Z formate din valoarea maximă a luminanței din fiecare pixel, iar pe baza acestor informații se pot obține informații legate de forma suprafeței probei.
10. Funcție de măsurare a dimensiunilor micro de înaltă precizie
Unitatea de recepție a luminii adoptă un senzor de imagine CCD 1-dimensional, astfel încât să nu fie afectată de înclinarea de scanare a dispozitivului de scanare, astfel încât măsurarea de înaltă precizie să poată fi finalizată. În plus, datorită utilizării funcției de memorie de deplasare a focalizării cu adâncime de focalizare reglabilă (aprofundare), eroarea de măsurare cauzată de deplasarea focalizării poate fi eliminată.
11. Analiza imaginilor tridimensionale
Folosind funcția de măsurare a formei suprafeței, puteți crea cu ușurință o imagine tridimensională a suprafeței probei. Nu numai că, dar, de asemenea, poate efectua o varietate de analize, cum ar fi: măsurarea rugozității suprafeței, suprafața, volumul, suprafața, circularitatea, raza, lungimea maximă, perimetrul, centrul de greutate, imaginea tomografică, transformarea FFT, măsurarea lățimii liniilor etc. .
Microscopul de scanare confocal cu laser poate fi utilizat nu numai pentru observarea morfologiei celulare, ci și pentru analiza cantitativă a componentelor biochimice intracelulare, statisticile densității optice și măsurarea morfologiei celulei.
