Microscopia cu fluorescență cu doi fotoni are multe avantaje
1) Lumina cu lungime de undă lungă este mai puțin afectată de împrăștiere decât lumina cu lungime de undă scurtă și poate pătrunde cu ușurință în specimen;
2) Moleculele fluorescente din afara planului focal nu sunt excitate, permițând luminii de excitație să ajungă în planul focal, permițând luminii de excitație să pătrundă în specimene mai adânci;
3) Lumina aproape infraroșie cu lungime de undă lungă este mai puțin toxică pentru celule decât lumina cu lungime de undă scurtă;
4) La observarea specimenelor folosind un microscop cu doi fotoni, fotoalbirea și fototoxicitatea apar numai pe planul focal. Prin urmare, microscoapele cu doi fotoni sunt mai potrivite decât microscoapele cu un singur foton pentru observarea specimenelor groase, pentru observarea celulelor vii sau pentru efectuarea experimentelor de fotoalbire cu punct fix.
Cunoștințe despre microscopia confocală cu fluorescență
Principiul de bază al microscopiei cu fluorescență confocală: utilizați o sursă de lumină punctuală pentru a ilumina specimenul pentru a forma un punct de lumină mic, bine definit pe planul focal. Fluorescența emisă de spot după iluminare este colectată de lentila obiectiv și returnată în oglinda dicroică de-a lungul căii luminii de iluminare inițială. constituie un separator de fascicul. Spectrometrul trimite fluorescența direct la detector. Există un orificiu în fața sursei de lumină și a detectorului, care sunt numite orificiu de iluminare și, respectiv, orificiu de detectare. Dimensiunile geometrice ale celor două sunt consistente, aproximativ 100-200nm; în raport cu punctul de lumină de pe planul focal, cele două sunt conjugate, adică punctul de lumină trece printr-o serie de lentile și poate fi focalizat în cele din urmă pe orificiul de iluminare și pe orificiul de detectare în același timp. În acest fel, lumina din planul focal poate fi concentrată în orificiul de detecție, în timp ce lumina împrăștiată de deasupra sau de sub planul focal este blocată în afara orificiului de detectare și nu poate fi fotografiată. Eșantionul este scanat punct cu punct cu laserul, iar tubul fotomultiplicator din spatele orificiului de detectare obține, de asemenea, imaginea confocală a punctului cu punct de lumină corespunzătoare, care este convertită într-un semnal digital și transmisă computerului și, în final, este agregată. pe ecran într-o imagine confocală clară a întregului plan focal. .
Fiecare imagine în plan focal este de fapt o secțiune transversală optică a specimenului. Această secțiune transversală optică are întotdeauna o anumită grosime și se mai numește și secțiune optică subțire. Deoarece intensitatea luminii la focalizare este mult mai mare decât intensitatea luminii la non-focalizare, iar lumina planului nefocal este filtrată de orificiu, adâncimea de câmp a sistemului confocal este aproximativ zero. Scanarea de-a lungul direcției axei Z poate realiza tomografie optică, formând secțiunea optică bidimensională dorită la punctul focalizat al probei. Prin combinarea scanării în plan XY (plan focal) cu scanarea pe axa Z (axa optică), prin acumularea de niveluri continue de imagini bidimensionale și procesarea acestora cu software de calculator specializat, se poate obține o imagine tridimensională a probei.
Adică, orificiul de detectare și orificiul de lumină sunt întotdeauna focalizate în același punct, astfel încât fluorescența excitată în afara planului de focalizare nu poate intra în orificiul de detectare.
Simpla expresie a principiului de lucru al laserului confocal este că folosește laserul ca sursă de lumină. Pe baza imaginilor tradiționale cu microscopul cu fluorescență, se adaugă un dispozitiv de scanare cu laser și un dispozitiv de focalizare conjugat, iar sistemul este controlat de un computer pentru a colecta și procesa imagini digitale.
