Scopul, atributele și utilizarea unui microscop cu fluorescență
Principiul și caracteristicile structurale ale microscopului cu fluorescență: microscopul cu fluorescență utilizează o sursă de lumină punctuală cu eficiență luminoasă ridicată pentru a emite o anumită lungime de undă a luminii (cum ar fi lumina ultravioletă 3650 inchi sau lumina albastră violet 4200 in) prin sistemul de filtrare ca excitare lumină pentru a stimula fluorescența din specimen. După ce substanța emite fluorescență de diferite culori, se observă prin mărirea lentilei obiectivului și a ocularului. În acest fel, sub un fundal de contrast puternic, chiar dacă fluorescența este foarte slabă, este ușor de identificat și are o sensibilitate ridicată. Este utilizat în principal pentru cercetarea structurii și funcției celulare și a compoziției chimice. Structura de bază a unui microscop cu fluorescență este compusă dintr-un microscop optic obișnuit plus unele accesorii (cum ar fi o sursă de lumină fluorescentă, un filtru de excitație, un divizor de fascicul cu două culori și un filtru de blocare etc.). Sursă de lumină fluorescentă—utilizați în general o lampă cu mercur de ultra-înaltă presiune (50-200W), care poate emite lumină de diferite lungimi de undă, dar fiecare substanță fluorescentă are o lungime de undă de excitație care produce cea mai puternică fluorescență, deci un filtru de excitație ( În general, există filtre de excitație ultraviolete, violete, albastre și verzi), care permit doar trecerea luminii de excitație cu o anumită lungime de undă și iradierea specimenului, absorbind în același timp altă lumină. După ce fiecare substanță este iradiată de lumina de excitație, emite fluorescență vizibilă cu o lungime de undă mai mare decât lungimea de undă de iradiere într-un timp foarte scurt. Fluorescența este specifică și în general mai slabă decât lumina de excitație. Pentru a observa fluorescența specifică, este necesar un filtru de blocare (sau suprimare) în spatele lentilei obiectivului.
Are două funcții: una este să absoarbă și să blocheze intrarea luminii de excitație în ocular, pentru a nu perturba fluorescența și a deteriora ochii; celălalt este să selectați și să lăsați fluorescența specifică să treacă, arătând o culoare fluorescentă specifică. Cele două filtre trebuie folosite împreună.
Există două tipuri de microscoape cu fluorescență în ceea ce privește căile lor optice:
1. Microscop cu fluorescență cu transmisie: Sursa de lumină de excitație este trecută prin materialul eșantionului printr-o lentilă de condensare pentru a excita fluorescența. Un colector de câmp întunecat este folosit în mod obișnuit, iar un colector obișnuit poate fi, de asemenea, utilizat pentru a regla oglinda, astfel încât lumina de excitație să fie redirecționată și ocolită către specimen. Acesta este un microscop fluorescent mai vechi. Avantajul este că fluorescența este puternică la mărire scăzută, dar dezavantajul este că fluorescența scade odată cu creșterea măririi. Prin urmare, este mai bine să observați materiale de eșantionare mai mari.
2. Microscopul epi-fluorescență este un nou tip de microscop cu fluorescență dezvoltat în timpurile moderne. Diferența este că lumina de excitație cade de la lentila obiectivului în jos pe suprafața specimenului, adică aceeași lentilă obiectiv este folosită ca condensatorul de iluminare și lentila obiectiv pentru colectarea fluorescenței. Un separator de fascicul dicroic trebuie adăugat în calea luminii, care este la 45 de grade distanță de uraniul ușor. Lumina de excitație este reflectată în lentila obiectivului și colectată pe probă. Fluorescența generată de probă și lumina de excitație reflectată de suprafața lentilei obiectivului și suprafața de acoperire a sticlei intră în lentila obiectivului în același timp și revin la separatorul de fascicul cu două culori pentru a face lumina de excitare separată de fluorescență , lumina de excitație reziduală este absorbită de filtrele de blocare. Cum ar fi schimbarea la o combinație de filtru de excitație diferit/divizor de fascicul cu două culori/filtru de blocare, poate satisface nevoile diferitelor produse de reacție fluorescente. Avantajul acestui tip de microscop cu fluorescență este că iluminarea câmpului vizual este uniformă, imaginea este clară și cu cât mărirea este mai mare, cu atât fluorescența este mai puternică.
(2) Cum se utilizează microscopul cu fluorescență.
1. Porniți sursa de lumină, iar lampa cu mercur de ultra-înaltă presiune trebuie să se încălzească câteva minute pentru a ajunge la punctul cel mai luminos.
2. Microscopul cu fluorescență de transmisie trebuie să instaleze filtrul de excitație necesar între sursa de lumină și condensator și să instaleze filtrul de blocare corespunzător în spatele lentilei obiectivului. Microscoapele cu epifluorescență trebuie să introducă filtrul de excitație necesar/separatorul de fascicul cu două culori/inserțiile filtrului de blocare în fantele din calea optică.
3. Observați cu o lentilă cu mărire redusă și reglați centrul sursei de lumină astfel încât să fie situat în centrul întregului punct de iluminare în funcție de dispozitivul de reglare al diferitelor modele de microscoape cu fluorescență.
4. Așezați piesa specimen și observați după focalizare. Atenție trebuie acordată în timpul utilizării: nu observați direct cu filtrul de capăt, pentru a nu provoca leziuni oculare; atunci când observați specimene cu o lentilă de ulei, trebuie să utilizați o lentilă de ulei specială fără fluorescență; după ce lampa cu mercur de înaltă presiune este oprită, nu poate fi pornită din nou imediat, trebuie testată. Poate fi repornit după 5 minute, altfel va fi instabil și va afecta durata de viață a lămpii cu mercur.
(3) Observație Folosind un filtru de lumină albastru-violet sub un microscop fluorescent pe platforma de predare, se poate observa că o. 01% din celulele colorate cu colorant fluorescent acridin portocaliu, nucleul și citoplasma sunt excitate pentru a produce două culori diferite de fluorescență (verde închis și roșu portocaliu).
