Principala metodă de observare a microscopului optic este observarea prin fluorescență
Fluorescența se referă la procesul în care o substanță fluorescentă emite lumină cu o lungime de undă mai mare aproape simultan atunci când este iradiată cu lumină de o anumită lungime de undă (Figura 1). Când lumina cu o anumită lungime de undă (lungime de undă de excitare) lovește o moleculă, cum ar fi cele dintr-un fluorofor, energia fotonului este absorbită de electronii moleculei. În continuare, electronii trec de la starea fundamentală (S0) la un nivel de energie mai înalt, starea excitată (S1'). Acest proces se numește excitație①. Electronul rămâne în stare excitată timp de 10-9–{10-8 secunde, timp în care electronul pierde ceva energie②. În timpul procesului de părăsire a electronilor din starea excitată (S1) și revenirea la starea fundamentală③, energia rămasă absorbită în timpul procesului de excitare este eliberată.
Timpul de rezidență al moleculei fluorescente în starea excitată este durata de viață a fluorescenței, care este în general la nivel de nanosecundă și este o caracteristică inerentă a moleculei fluorescente în sine. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), care utilizează tehnologia de imagistică cu fluorescență pe viață, se numește imagistica fluorescență pe viață (FLIM). În plus față de imagistica cu intensitatea fluorescenței, pot fi obținute măsurători funcționale și precise mai aprofundate pentru a obține conformația moleculară, interacțiunile intermoleculare și micromediul moleculelor. Informații greu de obținut cu imagistica optică convențională.
O altă proprietate importantă a fluorescenței este deplasarea Stokes, diferența de lungime de undă dintre vârfurile de excitație și de emisie (Figura 2). De obicei, lungimea de undă de emisie este mai mare decât lungimea de undă de excitație. Acest lucru se datorează faptului că electronii își vor pierde o parte din energia prin procesul de relaxare după ce substanța fluorescentă este excitată și înainte de a elibera fotoni. Substanțele fluorescente cu deplasări Stokes mai mari sunt mai ușor de observat la microscop cu fluorescență.
Microscopie cu fluorescență și cuburi cu filtre de fluorescență
Microscopul cu fluorescență este un microscop optic care utilizează proprietăți de fluorescență pentru observare și imagistică și este utilizat pe scară largă în diverse domenii, cum ar fi biologia celulară, neurobiologia, botanică, microbiologie, patologie și genetică. Imagistica prin fluorescență are avantajele sensibilității ridicate și specificității ridicate și este foarte potrivită pentru observarea distribuției proteinelor și organelelor specifice în țesuturi și celule, studiul colocalizării și interacțiunii, urmărirea proceselor dinamice ale vieții, cum ar fi modificările concentrației ionilor. , etc.
Majoritatea moleculelor din celule nu fac fluorescență și pentru a le vedea trebuie să fie marcate fluorescent. Există multe metode de marcare fluorescentă, cum ar fi marcarea directă (cum ar fi utilizarea DAPI pentru a marca ADN-ul) sau imunocolorarea folosind proprietățile de legare a antigenului ale anticorpilor sau utilizarea proteinelor fluorescente (cum ar fi GFP, proteina fluorescentă verde) pentru a marca proteinele țintă. , și legare reversibilă. Coloranți sintetici (cum ar fi Fura-2) și așa mai departe.
În prezent, microscopul cu fluorescență a devenit echipamentul standard de imagistică al diferitelor laboratoare și platforme de imagistică și este un bun ajutor pentru experimentele noastre zilnice. Microscoapele cu fluorescență sunt împărțite în principal în trei categorii: microscoape cu fluorescență verticale (potrivite pentru feliere), microscoape cu fluorescență inversată (potrivite pentru celule vii, ținând cont de feliere), stereoscoape fluorescente (potrivite pentru specimene mai mari, cum ar fi plante, pește-zebra (adult/embrion) ), medaka, organe de șoarece/șobolan etc.).
Blocul de filtru de fluorescență este componenta de bază a imaginilor cu fluorescență la microscop. Este format din trei părți: filtru de excitație, filtru de emisie și separator de fascicul dicroic. Este instalat în roata filtrului. De exemplu, Leica DMi8 este echipat cu o roată de filtru de 6-poziție (Fig. 3). Numărul de poziții ale diferitelor roți ale microscopului va fi diferit, iar unele microscoape folosesc diapozitive cu bloc de filtrare.
Blocul de filtru joacă un rol important în imagistica prin fluorescență: filtrul de excitare selectează lumina de excitare pentru a excita proba și blochează lumina de alte lungimi de undă; lumina care trece prin filtrul de excitație trece prin oglinda dicroică (funcția sa este de a reflecta lumina de excitație și de a transmite fluorescența), după reflexie, este focalizată de lentila obiectiv, iradiază proba și excită fluorescența corespunzătoare, adică , lumină emisă. Lumina emisă este colectată de lentila obiectivului, trece prin separatorul de fascicul dicroic și ajunge la filtrul de emisie. După cum se arată în Figura 4: lungimea de undă de excitație este de 450-490 nm, oglinda dicroică reflectă lumina mai scurtă de 510 nm, transmite lumină mai lungă de 510 nm și intervalul de recepție a luminii emise este de 520-560 nm.
