Principala metodă de observare a microscopului optic este observarea prin fluorescență
Fenomen de fluorescență
Fluorescența se referă la procesul în care o substanță fluorescentă emite lumină cu o lungime de undă mai mare aproape simultan atunci când este iradiată cu lumină de o anumită lungime de undă (Figura 1). Când lumina de o anumită lungime de undă (lungime de undă de excitare) lovește o moleculă (cum ar fi o moleculă dintr-un fluorofor), energia fotonului este absorbită de electronii moleculei. În continuare, electronii trec de la starea fundamentală (S0) la un nivel de energie mai înalt, starea excitată (S1'). Acest proces se numește excitație①. Electronul rămâne în starea excitată timp de 10-9–{10-8 secunde, timp în care electronul pierde ceva energie ②. În procesul de părăsire a stării excitate (S1) și revenire la starea fundamentală ③, energia rămasă absorbită în timpul procesului de excitare va fi eliberată.
Timpul de rezidență al unei molecule fluorescente în starea excitată este durata de viață a fluorescenței, în general în nanosecunde, care este o caracteristică inerentă a moleculei fluorescente în sine. Tehnologia imagistică care utilizează durata de viață a fluorescenței se numește Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), care poate efectua măsurători funcționale și precise mai aprofundate, pe lângă imagistica cu intensitatea fluorescenței, pentru a obține conformația moleculară, interacțiunile intermoleculare și micromediile moleculare. informații care sunt dificil de obținut cu imagistica optică convențională.
O altă proprietate importantă a fluorescenței este deplasarea Stokes, diferența de lungime de undă dintre vârfurile de excitație și de emisie (Figura 2). De obicei, lungimea de undă a luminii de emisie este mai mare decât lungimea de undă a luminii de excitație. Acest lucru se datorează faptului că după ce substanța fluorescentă este excitată și înainte ca fotonul să fie eliberat, electronii vor pierde o parte din energie prin procesul de relaxare. Substanțele fluorescente cu deplasări Stokes mai mari sunt mai ușor de observat la microscop cu fluorescență.
Microscoape cu fluorescență și blocuri cu filtre de fluorescență
Microscopia cu fluorescență este un microscop optic care folosește proprietățile fluorescenței pentru a observa și imagine și este utilizat pe scară largă în biologie celulară, neurobiologie, botanică, microbiologie, patologie, genetică și alte domenii. Imagistica prin fluorescență are avantajele sensibilității ridicate și specificității ridicate și este foarte potrivită pentru observarea distribuției proteinelor specifice, organitelor etc. în țesuturi și celule, studiul co-localizării și interacțiunii și urmărirea dinamicii vieții. procese precum modificări ale concentrației ionilor.
Majoritatea moleculelor din celule nu fac fluorescență și, pentru a le vedea, trebuie să fie marcate fluorescent. Există multe metode de marcare fluorescentă, care pot fi marcate direct (cum ar fi utilizarea DAPI pentru a marca ADN-ul) sau imunocolorare folosind proprietățile de legare a antigenului ale anticorpilor, sau proteina țintă poate fi marcată cu proteine fluorescente (cum ar fi GFP, verde proteină fluorescentă) sau legare reversibilă. coloranți sintetici (cum ar fi Fura-2), etc.
În prezent, microscopul cu fluorescență a devenit echipamentul standard de imagistică al diferitelor laboratoare și platforme de imagistică și este un bun ajutor pentru experimentele noastre zilnice. Microscoapele cu fluorescență sunt împărțite în principal în trei categorii: microscoape cu fluorescență verticale (potrivite pentru secționare), microscoape cu fluorescență inversată (potrivite pentru celule vii, ținând cont de secțiuni), microscoape stereoscopice fluorescente (potrivite pentru specimene mai mari, cum ar fi plante, pește-zebra (adult/ embrion), medaka, organe de șoarece/șobolan etc.).
Blocul de filtru de fluorescență este componenta de bază a imaginilor cu fluorescență la microscoape. Este alcătuit dintr-un filtru de excitație, un filtru de emisie și un separator de fascicul dicroic. Este instalat în roata de filtru, cum ar fi Leica DMi8 echipată cu o roată de filtru de 6-poziție (Figura 3). ). Microscoape diferite au poziții diferite ale roților, iar unele microscoape folosesc lame cu filtru.
Blocul de filtru joacă un rol important în imagistica prin fluorescență: filtrul de excitare selectează lumina de excitare pentru a excita proba și blochează alte lungimi de undă de lumină; lumina care trece prin filtrul de excitație trece printr-un separator de fascicul dicroic (rolul său este de a reflecta lumina de excitație și de a transmite fluorescența), După reflectare, este focalizată de lentila obiectiv, iradiată la probă și fluorescența corespunzătoare este excitată la emit lumină. Lumina emisă este colectată de lentila obiectivului, trece prin separatorul de fascicul dicroic și ajunge la filtrul de emisie. După cum se arată în Figura 4: lungimea de undă de excitație este de 450-490 nm, diversorul de fascicul dicroic reflectă lumina mai scurtă de 510 nm, transmite lumină mai lungă de 510 nm și intervalul de recepție a luminii de emisie este de 520-560 nm.
Filtrele de fluorescență utilizate în mod obișnuit în microscoapele cu fluorescență pot fi împărțite în două tipuri: trecere lungă (LP pentru scurt) și trecere în bandă (BP pentru scurt). Trecerea de bandă este determinată de obicei de lungimea de undă centrală și de lățimea intervalului, cum ar fi 480/40, ceea ce înseamnă că lumina de la 460-500nm poate fi transmisă. Filtrele cu trecere lungă, cum ar fi 515 LP, trec lumina cu lungimi de undă mai mari de 515 nm (Figura 5).
Substanțele fluorescente au curba lor caracteristică de excitație (absorbție) și curba de emisie, vârful de excitație este lungimea de undă de excitație ideală (eficiență ridicată a excitației, care poate reduce energia luminii de excitare, poate proteja celulele și coloranții), iar curba de emisie este lungimea de undă de fluorescență de emisie gamă. Prin urmare, în experiment, vom alege lungimea de undă cât mai aproape de vârful de excitație posibil pentru excitare, iar intervalul de recepție trebuie să includă vârful de emisie. De exemplu, vârful de excitație al Alexa Fluor 488 este de 500 nm, iar filtrul de excitare de 480/40 poate fi selectat în microscopul cu fluorescență.
Detaliile cuburilor de filtrare pot fi vizualizate în software-ul de imagistică cu microscop. Înțelegerea coloranților și găsirea filtrului care se potrivește cel mai bine cu proba dvs. este esențială pentru imagistica cu fluorescență. Informațiile spectrale ale coloranților fluorescenți și proteinelor fluorescente sunt în general indicate în instrucțiuni și pot fi găsite și online.
În plus față de lungimile de undă de excitare și emisie ale sondelor fluorescente, selecția blocurilor de filtrare trebuie să ia în considerare, de asemenea, dacă există excitație nespecifică și dacă există culoare încrucișată pentru probele marcate multicolor. În plus, este necesar să se ia în considerare sursa de lumină fluorescentă utilizată. În prezent, sursele de lumină fluorescentă utilizate în mod obișnuit includ lămpile cu mercur, lămpile cu halogenuri metalice și sursele de lumină cu LED care s-au dezvoltat rapid în ultimii ani. Spectrul unei surse de lumină fluorescentă este continuu sau discontinuu, iar energia va fi diferită în diferite benzi de lungimi de undă. Sursa de lumină LED devine treptat principala sursă de lumină a microscopului cu fluorescență datorită benzii spectrale relativ înguste, producției de energie mai stabilă, duratei lungi de viață, protecție mai sigură și a mediului și multe alte avantaje.
Pe lângă blocul de filtru încorporat al microscopului, există și o roată rapidă externă (Figura 7). Viteza de conversie a filtrului adiacent roții rapide externe a Leica este de 27 ms, ceea ce poate realiza experimente multicolore de mare viteză, cum ar fi imagistica cu raportul FRET și Fura2 cu calciu. (Fig. 8) et al.
O mare varietate de tehnici de imagistică prin microscopie cu fluorescență
Pentru a satisface diferitele nevoi de imagistică cu fluorescență, pe lângă microscoapele cu fluorescență, au fost dezvoltate diverse soluții de imagistică prin microscopie cu fluorescență:
Sistemele de imagistică de înaltă definiție cu câmp larg, cum ar fi Leica THUNDER Imager, utilizează tehnologia inovatoare Clearing de la Leica pentru a elimina eficient semnalele de interferență non-focale în timpul imaginii, prezentând imagini clare și avantajele imaginii de mare viteză;
Microscopul de scanare laser confocal folosește găuri pentru a elimina interferența planului non-focal, realizează secționarea optică și obține imagini de înaltă definiție și imagini tridimensionale;
Microscoapele cu rezoluție ultra-înaltă și nanomicroscoapele care trec de limita de difracție pot observa structuri fine mai mici de 200 nm;
Un sistem de imagistică multifoton care utilizează principiul excitației multifotonice pentru imagistica țesutului gros și profund in vivo;
Tehnologie de imagistică în foile luminoase cu rezoluție temporală și spațială ridicată, viteză rapidă a imaginii, rezoluție înaltă, fototoxicitate scăzută, potrivită în special pentru cercetarea dezvoltării și observarea dinamică in vivo;
Imagistica fluorescentă pe durata de viață (FLIM), care nu este afectată de factori precum concentrația substanței fluorescente, fotoalbirea, intensitatea luminii de excitație etc., poate efectua măsurători funcționale și precise mai aprofundate;
Spectroscopia de corelație de fluorescență (FCS) și Spectroscopia de corelație încrucișată de fluorescență (FCCS), măsoară numărul molecular și coeficientul de difuzie al moleculelor fluorescente, analizând astfel concentrația moleculară, dimensiunea moleculară, vâscozitatea, mișcarea moleculară, legarea/disocierea moleculară și proprietățile optice moleculare;
Microscopia cu fluorescență cu reflexie internă totală (TIRF), cu rezoluție extrem de mare a axei z, este ideală pentru studiul structurii moleculare și dinamicii suprafețelor membranei celulare.
