Diferența dintre microscopul de fluorescență (doi fotoni, confocal) și microscop obișnuit
Principiul de bază al excitației cu doi fotoni este acela că la densitatea fototonului ridicat, moleculele fluorescente pot absorbi simultan doi fotoni cu lungime de undă lungă și pot emite un foton de lungime de undă mai scurtă după o perioadă scurtă de așa-numită durată de viață a stării excitate; Efectul este același cu utilizarea unui foton cu jumătate din lungimea de undă a lungimii de undă lungi pentru a excita moleculele fluorescente. Două excitații fotonice necesită o densitate ridicată a fototonului, iar pentru a evita celulele dăunătoare, microscopia cu doi fotoni folosește lasere cu impulsuri blocate în mod cu energie mare. Laserul emis de acest laser are o energie maximă ridicată și o energie medie scăzută, cu o lățime a pulsului de doar 100 de femtosecunde și o frecvență de până la 80 până la 100 megahertz. Atunci când utilizați o lentilă obiectivă cu diafragmă numerică ridicată pentru a focaliza fotonii unui laser pulsat, densitatea fotonului în punctul focal al obiectivului obiectiv este cea mai înaltă, iar excitația cu doi fotoni are loc doar în punctul focal al obiectivului obiectiv. Prin urmare, microscopul cu doi fotoni nu necesită o gaură confocală, ceea ce îmbunătățește eficiența detectării fluorescenței.
În fenomenele de fluorescență generală, datorită densității fotonului scăzut a luminii de excitație, o moleculă fluorescentă poate absorbi doar un foton la un moment dat și apoi emite un alt foton fluorescent prin tranziție radiativă, care este cunoscută sub numele de fluorescență unică foton. Pentru procese de excitație cu fluorescență folosind lasere ca surse de lumină, pot apărea fenomene de fluorescență cu două fotoni sau chiar multiphoton. În acest caz, sursa de lumină de excitație utilizată are o intensitate ridicată și o densitate de fotoni care îndeplinește cerința moleculelor fluorescente pentru a absorbi simultan doi fotoni. În procesul de utilizare a unui laser general ca sursă de lumină de excitație, densitatea fotonului este încă insuficientă pentru a produce fenomen de absorbție de doi fotoni. În mod obișnuit, se folosesc lasere cu impulsuri femtosecunde, cu putere instantanee care ajunge la nivelul megawatt. Prin urmare, lungimea de undă a fluorescenței cu doi fotoni este mai scurtă decât cea a luminii de excitație, echivalentă cu efectul produs de o jumătate de excitație a lungimii de undă de excitație.
Cunoștințe legate de microscopie cu fluorescență confocală
Principiul de bază al microscopiei cu fluorescență confocală este de a utiliza o sursă de lumină punctuală pentru a iradia eșantionul, formând un punct de lumină mic bine definit pe planul focal. Fluorescența emisă din acest loc după iradiere este colectată de obiectivul obiectiv și trimis înapoi de -a lungul căii de iradiere inițială către divizorul de fascicul compus dintr -o oglindă dicroică. Spectrometrul trimite fluorescență direct la detector. Există o gaură de pin în fața sursei de lumină, cât și a detectorului, numită gaură de iluminare, respectiv pinul de detectare. Dimensiunile geometrice ale celor două sunt consecvente, aproximativ 100-200 nm; În comparație cu locul luminos de pe planul focal, cele două sunt conjugate, ceea ce înseamnă că locul luminos trece printr -o serie de lentile și se poate concentra în cele din urmă atât pe pinul de iluminare, cât și pe pinul de detectare simultan. În acest fel, lumina din planul focal poate converge în intervalul orificiului de detectare, în timp ce lumina împrăștiată de deasupra sau sub planul focal este blocată în afara găurii de detecție și nu poate fi imaginată. Scanând punctul de eșantion cu punct cu un laser, tubul fotomultiplicator După detectarea gaura de pin obține, de asemenea, imaginea confocală corespunzătoare a punctului de vedere ușor, îl transformă într -un semnal digital și îl transmite pe computer și, în sfârșit
