Procedura standard pentru calibrarea polarizatoarelor într-un microscop polarizant
Microscopul cu fluorescență este diferit de microscopul optic obișnuit prin faptul că nu observă specimene sub iluminarea surselor de lumină obișnuite. În schimb, folosește o anumită lungime de undă a luminii (de obicei, lumină ultravioletă, lumină albastră violetă) pentru a excita substanțele fluorescente din interiorul specimenului sub microscop, determinându-le să emită fluorescență. Prin urmare, rolul sursei de lumină în microscopul cu fluorescență nu este iluminarea directă, ci ca sursă de energie pentru a excita substanțele fluorescente din interiorul specimenului. Motivul pentru care putem observa specimene nu se datorează iluminării sursei de lumină, ci fenomenului de fluorescență manifestat de substanțele fluorescente din interiorul specimenului după absorbția energiei luminoase excitate. Din aceasta, se poate observa că caracteristica microscopiei cu fluorescență este în principal aceea că sursa sa de lumină poate furniza o cantitate mare de lumină de excitație într-un interval specific de lungimi de undă, astfel încât substanțele fluorescente din specimen să poată obține intensitatea necesară a luminii de excitație. În același timp, microscoapele cu fluorescență trebuie să aibă sisteme de filtrare corespunzătoare. Microscopul cu fluorescență este un instrument fundamental în chimia țesuturilor cu fluorescență. Este compus din componente principale, cum ar fi o sursă de lumină de ultra-înaltă tensiune, un sistem de filtrare (inclusiv plăci de filtrare pentru excitație și suprimare), un sistem optic și un sistem de fotografie. Utilizează lumină de o anumită lungime de undă pentru a excita specimenul și pentru a emite fluorescență.
1. Metode de excitare a fluorescenței: În funcție de intervalul de lungimi de undă a luminii, există două tipuri: metoda de excitare UV (folosind iluminarea ultravioletă) și metoda de excitare BV (folosind lumină albastră violetă). Metoda de excitare UV folosește lumină aproape ultravioletă mai scurtă de 400 nm pentru excitare. Această metodă nu are lumină de excitație vizibilă, astfel încât fluorescența observată prezintă fluorescența inerentă a colorantului, ceea ce face ușoară distingerea fluorescenței specifice pe specimen de fluorescența proprie a țesutului de fundal.
2. Metoda de excitare BV: implică excitarea de la ultravioletă la lumina albastră centrată la 404nm și 434nm. Această metodă utilizează lumină albastră pentru a iradia specimenul, astfel încât filtrul-de oprire al sistemului de observare a fluorescenței trebuie să utilizeze un filtru care poate bloca complet lumina albastră și poate trece complet prin fluorescența verde și galbenă necesară. Pigmenți fluorescenți utilizați pentru metoda anticorpilor fluorescenți. Lungimea de undă maximă de absorbție a luminii de excitație și lungimea de undă maximă de emisie a fluorescenței sunt relativ apropiate, astfel încât filtrul utilizat în metoda de excitare BV trebuie să folosească un filtru tăiat ascuțit. Această metodă poate folosi lumina albastră ca lumină de excitație, astfel încât eficiența de absorbție a pigmenților fluorescenți este mare și se pot obține imagini mai luminoase. Dezavantajul este că fluorescența sub 500nm nu poate fi văzută, în timp ce fluorescența peste 500nm face ca întreaga imagine să pară galbenă. În metoda anticorpilor fluorescenți, specificitatea este determinată în cea mai mare parte de culoarea unică a pigmenților fluorescenți, astfel încât atunci când discutăm despre specificitatea subtilă, dezavantajele metodei de excitare a BV menționate mai sus au adesea un impact semnificativ.
