Tehnici de colorare și observare microscopică a microorganismelor
1. Scop
1.1 Învățați tehnicile de bază ale frotiurilor și colorării microbiene.
1.2 Stăpânește metoda simplă de colorare a bacteriilor.
1.3 Înțelegerea preliminară a caracteristicilor morfologice ale bacteriilor și consolidarea cunoștințelor de utilizare a lentilelor de ulei și a tehnicilor de operare aseptică.
2 Principii
Întinderea și colorarea bacteriilor este o tehnică de bază în experimentele de microbiologie. Celulele bacteriene sunt mici și transparente, ceea ce le face dificil de identificat la un microscop cu lumină obișnuită; trebuie să fie pătate. Un singur colorant este folosit pentru a vopsi bacteriile, astfel încât bacteriile colorate să formeze o diferență clară de culoare față de fundal, astfel încât morfologia și structura lor să poată fi observate mai clar. Această metodă este ușor de utilizat și potrivită pentru observarea formei generale a celulelor bacteriene și a aranjamentului bacteriilor. Coloranții de bază sunt utilizați în mod obișnuit pentru colorarea simplă. Acest lucru se datorează faptului că în soluțiile neutre, alcaline sau slab acide, celulele bacteriene sunt de obicei încărcate negativ, iar atunci când coloranții bazici sunt ionizați, partea de vopsire a moleculelor lor este încărcată pozitiv, deci sunt alcaline. Partea colorantă a colorantului se combină cu ușurință cu bacteriile pentru a le colora. Celulele bacteriene colorate contrastează puternic cu fundalul, făcându-le mai ușor de identificat la microscop. Coloranții utilizați în mod obișnuit pentru vopsirea simplă includ albastru de metilen, violet cristal, fuchsin bazic etc. Când bacteriile descompun zaharurile și produc acid, determinând scăderea pH-ului mediului de cultură, sarcina pozitivă a bacteriilor crește. În acest moment, coloranții acizi precum eozina, fucsina acidă sau roșu Congo pot fi folosiți pentru colorare. Bacteriile trebuie fixate înainte de colorare. Are două scopuri: unul este de a ucide bacteriile și de a le face să adere la lama de sticlă; celălalt este de a le crește afinitatea pentru coloranți. Două metode frecvent utilizate sunt încălzirea și fixarea chimică. La fixare, încercați să mențineți forma originală a celulelor.
3 materiale
3.1 Bacterii: cultură înclinată cu agar nutrient Bacillus subtilis 12-18h, cultură înclinată cu agar nutrient Staphylococcus aureus 24h, cultură înclinată cu agar nutrient Escherichia coli 24h, cultură înclinată cu agar cu drojdie de panificație.
3.2 Agent de colorare: colorant alcalin de albastru de metilen al lui Lu (sau colorant violet cristal de oxalat de amoniu), colorant fuchsin acid carbolic.
3.3 Instrumente sau alte ustensile: microscop, lampă cu alcool, lamă, buclă de inoculare, suport pentru lame, sticlă cu două straturi (conținând ulei de cedru și xilen), țesut pentru lentile, ser fiziologic sau apă distilată etc.
4. Proces: frotiu → uscare → fixare → colorare → spălare → uscare → examinare microscopică.
5 pași
5.1 Frotiu: Luați două lame de sticlă curate și fără ulei. În condiții sterile, puneți o picătură mică de soluție salină normală (sau apă distilată) pe fiecare centru al lamei de sticlă. Utilizați o ansă de inoculare pentru a steriliza bacteriile din Bacillus subtilis. , Micrococcus luteus și Escherichia coli, culegeți puțin gazon bacterian în picăturile de apă de pe înclinare, amestecați bine și aplicați-l într-o peliculă subțire. Dacă utilizați un frotiu în suspensie bacteriană (sau cultură lichidă), puteți utiliza o ansă de inoculare pentru a alege 2 până la 3 anse și a le aplica direct pe lamă. Aveți grijă să nu scăpați prea multă soluție salină fiziologică (apă distilată) și îndepărtați bacteriile și aplicați-o uniform și nu prea gros.
5.2 Uscare Uscați în mod natural la temperatura camerei. De asemenea, îl puteți încălzi ușor peste o lampă cu alcool, cu partea acoperită în sus, pentru a-l usca. Dar asigurați-vă că nu vă apropiați prea mult de flacără, deoarece o temperatură prea ridicată va distruge morfologia bacteriilor.
5.3 Fixare Dacă se utilizează uscare încălzită, fixarea și uscarea sunt combinate într-o singură etapă, iar metoda este aceeași cu uscarea. Se unge, se usucă și se fixează la căldură.
5.4 Colorare: Așezați lama plat pe suportul pentru diapozitive și adăugați 1 până la 2 picături de soluție de colorant pe frotiu (este potrivit ca soluția de colorant să acopere doar pelicula de frotiu). Se colorează cu albastru de metilen bazic Lu timp de 1 până la 2 minute și se colorează cu acid carbolic fuchsin (sau oxalat de amoniu violet cristal) timp de aproximativ 1 minut.
5.5 Spălare cu apă: Se toarnă soluția de colorant și se clătește ușor cu apă de la robinet de la un capăt al lamei până când apa care curge din frotiu este incoloră. Când spălați cu apă, nu spălați suprafața acoperită direct cu apă. Debitul de apă nu trebuie să fie prea rapid sau prea mare pentru a preveni căderea peliculei de pete.
5.6 Uscarea: Se scutura picăturile de apă de pe lamă și se usucă în mod natural, se usucă cu un uscător de păr sau se absoarbe cu hârtie absorbantă (ai grijă să nu ștergi bacteriile). 5.7 Examinarea microscopică După ce frotiul este uscat, efectuați examinarea microscopică. Frotiul trebuie să fie complet uscat înainte de a fi vizualizat cu o lentilă de ulei.
6 Rezultate Desenați morfologia E. coli și Micrococcus luteus observată după o singură colorare.
