Tehnici de colorare și observare microscopică a microorganismelor
Colorarea simplă a bacteriilor
1 Obiective
1.1 Să învețe tehnicile de bază ale frotiului și colorării microbiene.
1.2 Să stăpânească metoda simplă de colorare a bacteriilor.
1.3 Să cunoască caracteristicile morfologice ale bacteriilor și să consolideze învățarea utilizării oglinzii cu ulei și a tehnicilor de operare aseptică.
2 Principiu Frotiul și colorarea bacteriilor este o tehnică de bază în experimentele de microbiologie. Celulele bacteriilor sunt mici și transparente, nu sunt ușor de recunoscut la microscopul obișnuit și trebuie colorate. Utilizarea unui singur colorant pentru a colora bacteriile, astfel încât organismul colorat și fundalul să formeze o diferență clară de culoare, astfel încât morfologia și structura lor să poată fi observate mai clar. Această metodă este ușor de realizat și este potrivită pentru observarea formei generale a organismului și a aranjamentului bacteriilor. Coloranții alcalini sunt utilizați în mod obișnuit pentru colorarea simplă, deoarece în soluții neutre, alcaline sau slab acide, celulele bacteriene sunt de obicei încărcate negativ, iar atunci când coloranții alcalini sunt ionizați, porțiunea colorantă a moleculelor lor este încărcată pozitiv, astfel încât porțiunea colorantă a coloranților alcalini. se poate lega cu ușurință de bacterii pentru a face bacteriile colorate. Celulele bacteriene colorate contrastează puternic cu fundalul și sunt mai ușor de recunoscut la microscop. Coloranții utilizați în mod obișnuit pentru colorarea simplă includ albastru de merocianină, violet cristal și roșu compus de bază. Când descompunerea bacteriană a zahărului pentru a produce acid, astfel încât pH-ul mediului scade, sarcina pozitivă a bacteriilor crește și apoi poate fi utilizată în colorarea roșu, roșu acid sau roșu Congo și alți coloranți acizi. Bacteriile trebuie fixate înainte de colorare. Scopul său este dublu: unul este de a ucide bacteriile și de a face bacteriile să adere la lamă; al doilea este de a crește afinitatea acestuia pentru colorant. Sunt utilizate în mod obișnuit două metode: încălzire și fixare chimică. Încercați să mențineți morfologia originală a celulelor la fixare.
3 Materiale
3.1 Cultură înclinată cu agar nutritiv din tulpină Bacillus subtilis 12-18h, cultură înclinată cu agar nutrient Staphylococcus aureus aproximativ 24 de ore, cultură oblică cu agar nutrient Escherichia coli 24 ore, cultură înclinată cu agar cu drojdie de panificație.
3.2 Colorare Colora albastru de metilen alcalină Lue (sau colorația violet cristal de oxalat de amoniu), colorația roșie a compusului de acid carbolic.
3.3 Instrumente sau alte accesorii Microscop, lampă cu alcool, lamă, inel de inoculare, suport pentru lame, sticlă cu două straturi (umplută cu ulei de cedru și xilen), hârtie pentru microscop, ser fiziologic sau apă distilată etc.
4 Procedură Frotiu → uscare → fixare → colorare → spălare → uscare → examinare microscopică.
5 pași
5.1 frotiu Se iau două lame curate și fără ulei, fiecare cu o picătură mică de ser fiziologic (sau apă distilată) în centrul lamei în condiții aseptice, cu un inel de inoculare pentru a opera aseptic, respectiv, din Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus și Escherichia coli înclinată pentru a culege puțin mușchi în picătură de apă, amestecând și acoperit cu o peliculă. În cazul în care suspensia bacteriană (sau cultura lichidă) frotiu, poate fi utilizată pentru a inocula inelul pick 2 până la 3 inele direct pe lamă. Rețineți că soluția salină (apa distilată) și ia bacteriile nu trebuie să fie prea mult și să se răspândească uniform, nu prea gros.
5.2 Uscare Uscați în mod natural la temperatura camerei. De asemenea, poate fi uscat prin încălzire puțin deasupra unei lămpi cu alcool, cu partea acoperită în sus. Cu toate acestea, nu vă apropiați prea mult de flacără, deoarece temperatura este prea ridicată va distruge morfologia bacteriilor.
5.3 Fixare Dacă se utilizează uscare la căldură, fixarea și uscarea sunt combinate într-o singură etapă, în același mod ca uscarea. Se unge, se usucă și se fixează la căldură.
5.4 Colorare Așezați lama plat pe raftul pentru diapozitive, adăugați 1 până la 2 picături de soluție de colorare pe frotiu (soluția de colorare acoperă doar filmul de frotiu este adecvată). Se colorează frotiu cu Lü's Basic Mellanox Blue timp de 1~2 minute și cu roșu carbonat (sau violet cristal de oxalat de amoniu) timp de aproximativ 1 min.
5.5 Clătirea Turnați soluția de colorare și clătiți ușor cu apă de la robinet de la un capăt al lamei până când apa care curge din frotiu este incoloră. Când clătiți, nu lăsați apa să curgă direct pentru a spăla suprafața acoperită. Debitul de apă nu trebuie să fie prea rapid sau prea mare pentru a evita dislocarea peliculei de pete.
5.6 Uscarea Scuturați picăturile de apă de pe lamă pentru a se usca în mod natural, uscați cu suflarea sau hârtie absorbantă pentru a absorbi uscat (aveți grijă să nu ștergeți corpul bacterian). 5.7 Examinarea microscopică Frotiul este uscat și examinat prin microscopie. Frotiul trebuie să fie complet uscat înainte de a putea fi observat cu un microscop cu ulei.
6 Rezultate Desenați morfologia E. coli și Micrococcus garciniae după o singură colorare.
Pata Gram
1. Scop
1.1 Să înțeleagă principiul colorației Gram și importanța acestuia în clasificarea și identificarea bacteriilor.
1.2 Să învețe și să stăpânească tehnica colorării Gram și să consolideze învățarea utilizării lentilei de ulei a microscopului optic.
