Principiile microscopiei confocale cu laser (LSCM)
Un microscop confocal laser folosește un orificiu de iluminare plasat în spatele sursei de lumină și un orificiu de detectare plasat în fața detectorului pentru a obține iluminarea punctului și detectarea punctului. Lumina de la sursa de lumină este focalizată pe un punct din planul focal al probei de lumina emisă prin orificiul de iluminare, iar fluorescența emisă din acel punct este imaginea în orificiul de detectare, iar orice lumină emisă în afara acelui punct este blocată de orificiu de detectare. Orificiul de iluminare și orificiul de detectare sunt conjugate pentru punctul iluminat sau detectat, astfel încât punctul detectat este punctul confocal și planul în care se află punctul detectat este planul confocal. Computerul afișează punctul detectat pe ecranul computerului sub forma unui punct de imagine. Pentru a produce o imagine completă, un sistem de scanare în calea optică scanează peste planul focal al probei, producând astfel o imagine confocală completă. Atâta timp cât stadiul purtător este mutat în sus și în jos de-a lungul axei Z, un nou nivel al eșantionului este mutat în planul confocal, iar noul nivel al eșantionului este imaginea pe monitor, pe măsură ce axa Z continuă să mișcare, se obțin imagini succesive tăiate în lumină ale diferitelor niveluri ale eșantionului.
Microscopul optic tradițional folosește o sursă de lumină de câmp, imaginea fiecărui punct de pe specimen va fi interferată de difracția sau împrăștierea luminii din punctele învecinate; Microscopul confocal cu scanare laser folosește un fascicul laser prin orificiul iluminat pentru a forma o sursă de lumină punctuală pe specimenul scanat în fiecare punct al planului focal intern, specimenul pe punctul iradiat, imaginea orificiului de detecție, prin detectarea orificiului. după tubul de multiplicare a punctului de lumină (PMT) sau dispozitivul electrocuplat la rece (cCCD) Primit punct cu punct sau linie cu linie, pe ecranul monitorului computerului se formează rapid o imagine fluorescentă. Orificiul de iluminare și orificiul de detectare în raport cu planul focal al lentilei obiectiv sunt conjugate, punctul de pe planul focal este concentrat în același timp pe orificiul de iluminare și pe orificiul de emisie, punctul din afara planului focal nu va fi în detectarea gaură la imagine, astfel încât imaginea confocală obținută este secțiunea transversală optică a specimenului, depășind deficiențele imaginii obișnuite ale microscopului neclar.
Din principiul de bază, microscopul confocal laser este un microscop optic modern, este microscopul obișnuit de lumină din tehnologie pentru a face următoarele îmbunătățiri.
1. Utilizați laserul ca sursă de lumină deoarece monocromaticitatea laserului este foarte bună, lungimea de undă a fasciculului sursei de lumină este aceeași, eliminând fundamental aberația cromatică.
2. Utilizarea tehnologiei confocale în planul focal al lentilei obiectiv plasat în mijloc cu un mic orificiu în deflector, planul focal în afara luminii rătăcite blocând, eliminând aberația sferică; și elimină în continuare aberația cromatică.
3. Microscop confocal laser care utilizează tehnologia de scanare punctuală pentru a descompune proba în spațiu bidimensional sau tridimensional în nenumărate puncte, cu un fascicul laser foarte mic (sursă de lumină punctuală) punct cu punct, linie cu linie de scanare a imaginii și apoi prin combinația de microcomputer a unui plan întreg sau a unei imagini tridimensionale. Microscopul tradițional cu lumină este o sursă de lumină de câmp în cadrul imaginii unice, specimenele din fiecare punct al imaginii vor fi adiacente punctului de lumină difractată și interferență luminoasă împrăștiată. Claritatea și precizia acestor două imagini nu pot fi comparate.
4. Achizitia si prelucrarea semnalelor optice cu un calculator si amplificarea semnalelor cu un tub fotomultiplicator
În microscopul confocal laser, computerul înlocuiește ochiul uman sau camera pentru observare și înregistrare video, iar imaginile obținute sunt digitizate și pot fi procesate în computer pentru a îmbunătăți din nou claritatea imaginilor. Mai mult, utilizarea tuburilor fotomultiplicatoare poate amplifica semnale foarte slabe, îmbunătățind foarte mult sensibilitatea. Ca urmare a utilizării combinate a tehnologiilor de mai sus, se poate spune că LSCM este cel mai avansat microscop din lume. Se poate spune că LSCM este o combinație de tehnologie de producție a microscopului, tehnologie fotoelectrică, tehnologie computerizată **, este produsul inevitabil al dezvoltării tehnologiei moderne.
