Principiile microscopiei cu fluorescență
Microscoapele cu fluorescență sunt diferite de microscoapele optice obișnuite. În loc să observe specimenele sub iluminarea surselor obișnuite de lumină, ei folosesc lumină cu o anumită lungime de undă (de obicei lumină ultravioletă, lumină albastră-violetă) pentru a excita substanțele fluorescente din specimene la microscop pentru a le face să emită fluorescență. Prin urmare, sursa de lumină a unui microscop cu fluorescență nu funcționează ca iluminare directă, ci ca o sursă de energie care excită substanțele fluorescente din specimen. Motivul pentru care putem observa specimenul se datorează iluminării sursei de lumină, dar fenomenul de fluorescență prezentat după ce substanța fluorescentă din specimen absoarbe energia luminoasă excitată.
Se poate observa că caracteristica microscopului cu fluorescență este că sursa sa de lumină poate furniza o cantitate mare de lumină de excitație într-un interval specific de lungimi de undă, astfel încât substanța fluorescentă din specimenul testat să poată obține lumina de excitare de intensitatea necesară. În același timp, microscopul cu fluorescență trebuie să aibă sistemul de filtrare corespunzător.
Microscopia cu fluorescență este un instrument esențial în histochimia imunofluorescenței. Este compus din sursă de lumină de ultra-înaltă tensiune, sistem de filtrare (inclusiv placa de filtru de excitare și suprimare), sistem optic și sistem de fotografie și alte componente principale. Utilizează lumină de o anumită lungime de undă pentru a excita specimenul să emită fluorescență.
Modul de excitare a fluorescenței: În funcție de intervalul de lungimi de undă a luminii, aceasta poate fi împărțită în două tipuri: metoda de excitare UV (folosind metoda de iluminare ultravioletă) și metoda de excitare BV (folosind lumină albastru-violet). Metoda de excitare UV utilizează lumină aproape ultravioletă mai scurtă de 400 nm pentru excitare. Nu există lumină de excitație vizibilă în această metodă, astfel încât fluorescența observată prezintă fluorescența inerentă a colorantului și este ușor să distingem fluorescența specifică pe specimen de autofluorescența țesutului de fundal.
Metoda de excitare BV se bazează pe 404nm și 434nm pentru excitarea de la ultravioletă la lumina albastră. Această metodă utilizează lumină albastră pentru a iradia specimenul, astfel încât filtrul de tăiere al sistemului de observare a fluorescenței trebuie să utilizeze un filtru care poate bloca complet lumina albastră și poate trece complet fluorescența verde și galbenă necesară. Coloranți fluorescenți pentru teste de anticorpi fluorescenți. Lungimea de undă maximă de absorbție a luminii de excitație este relativ apropiată de lungimea de undă maximă de emisie a fluorescenței, astfel încât filtrul utilizat în metoda de excitare BV trebuie să folosească un filtru de tăiere ascuțit. Această metodă poate folosi lumina albastră ca lumină de excitație, astfel încât eficiența de absorbție a pigmentului fluorescent este mai mare și se poate obține o imagine mai strălucitoare. Dezavantajul său este că fluorescența sub 500nm nu poate fi văzută, iar fluorescența peste 500nm face ca întreaga imagine să pară galbenă. În metoda anticorpilor fluorescenți, specificitatea fluorocromului este adesea judecată după culoarea unică a fluorocromului. Prin urmare, atunci când se discută specificitatea subtilă, deficiențele menționate mai sus ale metodei de excitare BV au adesea o mare influență.
În concluzie, iluminarea microscopului cu fluorescență poate fi considerată în funcție de următoarele trei puncte, în funcție de structura condensatorului și de lungimea de undă a luminii de excitație.
① Din perspectiva cerințelor de contrast ale imaginii fluorescente, concentratorul de câmp întunecat cu excitație UV este utilizat pentru iluminare.
② Având în vedere luminozitatea imaginii, filtrul de excitație BV are cea mai mare eficiență de observare a câmpului întunecat.
③Caracteristicile de observare a filtrului de excitație UV în câmp întunecat și iluminare a concentratorului de câmp întunecat de excitație BV pot fi considerate între aceste două metode de iluminare, dar prima are proprietăți de câmp întunecat mai puternice și afișează imagini mai luminoase. Contrastul este mic; acesta din urmă păstrează proprietățile căii luminii câmp întunecat, astfel încât imaginea afișată este mai întunecată, iar contrastul este îmbunătățit. Atunci când se utilizează efectiv un microscop cu fluorescență, pentru observare ar trebui utilizată metoda de iluminare care se potrivește cel mai bine cerințelor specimenului.
Trebuie subliniat faptul că, chiar dacă este iluminat condensatorul de câmp întunecat excitat de UV cu cel mai bun contrast, o parte din lumina de excitație ultravioletă refractată sau împrăștiată de specimen va intra în lentila obiectivului. Autofluorescența poate înrăutăți răspunsul imaginii. Prin urmare, un filtru care absoarbe UV trebuie folosit în fața ocularului ca filtru de tăiere.
