Clasificarea microscopiei și principiul de lucru pentru cercetarea celulară
Microscopul este instrumentul principal pentru observarea celulelor. În funcție de diferite surse de lumină, acesta poate fi împărțit în două categorii: microscoape optice și microscoape electronice. Primul folosește lumina vizibilă (microscoapele UV folosesc lumină ultravioletă) ca sursă de lumină, în timp ce al doilea folosește fascicule de electroni ca sursă de lumină.
-,Microscop optic
(1) Microscop optic obișnuit
Microscoapele biologice obișnuite sunt compuse din trei părți, și anume: ① sistemul de iluminare, inclusiv sursa de lumină și condensatorul; ② sistem optic de mărire, compus din obiectiv și ocular, care este corpul principal al microscopului. Pentru a elimina aberația sferică și aberația cromatică, atât ocularul, cât și obiectivul ③Dispozitiv mecanic, utilizat pentru fixarea materialului și pentru a facilita observarea (Figura 2-1).
Dacă imaginea microscopului este clară nu este determinat doar de mărire, ci și de rezoluția microscopului. Rezoluția se referă la capacitatea microscopului (sau a ochiului uman de a fi la 25 cm distanță de țintă) de a distinge cea mai mică distanță dintre obiecte. Mărimea rezoluției este determinată de lungimea de undă și raportul de deschidere a luminii și indicele de refracție al mediului sunt exprimate prin formula:
În formula: n=indicele de refracție al mediului;=unghi de deschidere (unghiul de deschidere al specimenului față de deschiderea obiectivului), NA=diafragma obiectivului (apertura numerică). Unghiul lentilei este întotdeauna mai mic de 180 de grade, deci valoarea maximă a lui sina/2 trebuie să fie mai mică de 1.
Indicele de refracție al sticlei utilizate la realizarea lentilei optice este de 1,65 până la 1,78, iar indicele de refracție al mediului utilizat este mai aproape de sticlă, cu atât mai bine. Pentru obiectivele uscate, mediul este aerul, iar raportul de deschidere a obiectivului este, în general, 0.05 la 0,95; pentru lentilele cu ulei, uleiul de cedru este folosit ca mediu, iar raportul de deschidere a obiectivului poate fi aproape de 1,5.
Lungimea de undă a luminii obișnuite este de {{0}}nm, deci valoarea rezoluției microscopului nu va fi mai mică de 0,2μm, iar rezoluția ochiului uman este de 0,2mm, deci mărirea maximă a designului general al microscopului este de obicei 1000X.
(2) Microscopia cu fluorescență
Unele substanțe din celule, cum ar fi clorofila, pot avea fluorescență după ce au fost iradiate de razele ultraviolete; unele substanțe în sine nu pot fluoresce, dar dacă sunt colorate cu coloranți fluorescenți sau cu anticorpi fluorescenți, ele pot fluoresce și atunci când sunt iradiate de raze ultraviolete, iar microscopul cu fluorescență (Fig. 2-2, 3, 4) este unul dintre instrumente. pentru cercetări calitative și cantitative asupra unor astfel de substanțe.
Microscoapele cu fluorescență și microscoapele obișnuite au următoarele diferențe:
1. Metoda de iluminare este de obicei epi-iluminare, adică sursa de lumină este proiectată pe probă prin lentila obiectiv (Figura 2-3);
2. Sursa de lumină este lumină ultravioletă, lungimea de undă este mai scurtă și rezoluția este mai mare decât cea a microscoapelor obișnuite;
3. Există două filtre speciale, cel din fața sursei de lumină este folosit pentru a filtra lumina vizibilă, iar cel dintre ocular și lentila obiectiv este folosit pentru a filtra lumina ultravioletă pentru a proteja ochii.
(3) Microscop confocal cu scanare laser
Microscopul de scanare confocal cu laser (microscopul de scanare confocal cu laser, Figura 2-5, 6) folosește laserul ca sursă de lumină de scanare și scanează imaginea punct cu punct, linie cu linie, suprafață cu suprafață, iar colecția de laser de scanare și fluorescență partajează obiectiv, iar focalizarea lentilei obiectiv este Punctul focal al laserului de scanare este, de asemenea, punctul obiect al imaginii instantanee. Deoarece lungimea de undă a fasciculului laser este scurtă și fasciculul este foarte subțire, microscopul de scanare laser confocal are o rezoluție mai mare, care este de aproximativ 3 ori mai mare decât a unui microscop optic obișnuit. Sistemul este focalizat o singură dată și scanarea este limitată la un singur plan al probei. Când adâncimea de focalizare este diferită, se pot obține imagini cu diferite niveluri de adâncime ale probei. Aceste informații despre imagine sunt stocate în computer. Prin analiză și simulare pe calculator, structura tridimensională a probei de celule poate fi afișată.
Microscopia de scanare laser confocală poate fi utilizată nu numai pentru a observa morfologia celulară, ci și pentru analiza cantitativă a componentelor biochimice intracelulare, statisticile de densitate optică și măsurarea morfologiei celulare.
(4) Microscop cu câmp întunecat
Microscopul cu câmp întunecat (microscop cu câmp întunecat, figura 2-7) are o foaie de lumină în centrul condensatorului, astfel încât lumina de iluminare să nu pătrundă direct în lentila umană, ci doar lumina reflectată și difractată de specimen are voie să intre în lentila obiectivului, astfel încât fundalul câmpului vizual este negru, Marginile obiectelor sunt luminoase. Folosind acest microscop, pot fi văzute particule de până la 4-200nm, iar rezoluția poate fi de 50 de ori mai mare decât cea a microscoapelor obișnuite.
(5) Microscop cu contrast de fază
Microscopul cu contrast de fază (microscop cu contrast de fază, Figura 2-8, 9) de P. Zernike a fost inventat în 1932 și a câștigat Premiul Nobel pentru fizică în 1953 pentru acesta. Cea mai mare caracteristică a acestui microscop este că poate observa specimene nepătate și celule vii.
Principiul de bază al microscopiei cu contrast de fază este de a schimba diferența de cale optică a luminii vizibile care trece prin specimen într-o diferență de amplitudine, îmbunătățind astfel contrastul dintre diferite structuri și făcând diferite structuri clar vizibile. După trecerea prin eșantion, lumina este refractată, deviată de la calea optică inițială și întârziată cu 1/4λ (lungime de undă). Întăriți, creșteți sau micșorați amplitudinea, măriți contrastul. În ceea ce privește structura, microscoapele cu contrast de fază au două caracteristici speciale care sunt diferite de microscoapele optice obișnuite:
1. Diafragma inelară este situată între sursa de lumină și condensator, iar funcția sa este de a face lumina care trece prin condensator să formeze un con de lumină gol și să se concentreze asupra specimenului.
2. Placa de fază (placa de fază inelară) adaugă o placă de fază acoperită cu fluorură de magneziu în lentila obiectivului, care poate întârzia faza luminii directe sau a luminii difractate cu 1/4λ. Există două tipuri:
①O placă de fază plus: lumina directă este întârziată cu 1/4λ. După ce cele două grupuri de unde luminoase sunt combinate, undele luminoase sunt adăugate împreună, iar amplitudinea este mărită. Structura specimenului este mai luminoasă decât mediul înconjurător, formând un contrast luminos (sau contrast negativ).
② B plus placa de fază: lumina difractată este întârziată cu 1/4λ. După ce cele două seturi de raze sunt combinate, undele luminoase sunt scăzute, iar amplitudinea devine mai mică, formând un contrast întunecat (sau contrast pozitiv), iar structura este mai întunecată decât mediul înconjurător.
(6) Microscop polarizant
Microscopul polarizant este utilizat pentru a detecta substanțe cu birefringență, cum ar fi filamente, fusuri, colagen, cromozomi și așa mai departe. Diferența față de microscoapele obișnuite este că există un polarizator (polarizator) în fața sursei de lumină, astfel încât lumina care intră în microscop este lumină polarizată și există un analizor (un polarizator a cărui direcție de polarizare este perpendiculară pe polarizator) în cilindrul lentilei. Etapa acestui microscop poate fi rotită. Atunci când o substanță cu refracție unică este plasată pe scenă, indiferent de modul în care scena este rotită, deoarece cele două polarizatoare sunt verticale, nicio lumină nu poate fi văzută la microscop, iar lumina nu este vizibilă la microscop. La intrarea în materiale birefringente, treapta rotativă poate detecta astfel de obiecte deoarece lumina este deviată pe măsură ce trece prin astfel de materiale.
