Sala de clasă de imagistică microscopică丨Application of Fluorescence Microscopy
Microscopia cu fluorescență cu reflexie internă totală (TIRFM) este o tehnică care utilizează unda evanescentă generată de un fascicul de lumină care se propagă între două medii diferite cu indice de refracție pentru a sonda suprafața celulelor vii marcate fluorescent. În practică, atunci când un fascicul laser incident întâlnește interfața dintre lamelă și mediul apos care conține celulele, acesta este reflectat la unghiul critic (reflexie internă totală). Deoarece energia undei evanescente scade exponențial odată cu distanța de la lamelă, doar fluoroforele aflate la 10 nanometri de suprafață (între 10 și 200 nanometri) sunt excitate de unda evanescentă, în timp ce fluoroforii mai îndepărtați sunt în mare parte neexcitați. Afectat. Astfel, TIRFM are ca rezultat niveluri ridicate de semnal de la fluoroforele situate în apropierea lamei, suprapuse pe un fundal foarte întunecat, oferind un raport semnal-zgomot excelent. Limitarea extremă a adâncimii de excitație este ideală pentru studiul moleculelor individuale sau compoziția membranei și a organelor din celulele aderente din apropierea suprafeței lamei (a se vedea Figura 8(e)). Deoarece excitația este limitată la regiunile subțiri din apropierea lamei, fotoalbirea și fototoxicitatea sunt, de asemenea, limitate la aceste regiuni, făcând TIRFM una dintre cele mai utile metode pentru observarea pe termen lung. Tehnica a devenit un instrument fundamental pentru studierea unei game largi de fenomene din biologia celulară și moleculară.
Deconvoluția este un algoritm aplicat unui set de imagini cu focalizare completă dobândite de-a lungul axei optice (Z) pentru a îmbunătăți semnalul fotonic într-un teanc de imagini pentru un anumit plan de imagine sau mai multe planuri focale. Microscoapele trebuie să fie echipate cu unități de focalizare motorizate de înaltă precizie pentru a garanta achiziția imaginii la intervale precis definite între planurile focale ale probei. Într-o aplicație tipică (vezi Fig. 8(f)), procesul de deconvoluție este utilizat pentru a estompa și îndepărta lumina nefocalizată dintr-un plan focal dat folosind excitația și emisia fluorescenței cu câmp larg. Cea mai complexă aplicație este aplicarea procesului de deconvoluție întregului stivă de imagini pentru a genera vederi proiectate sau modele 3D. Un set de imagini cu câmp larg utilizat pentru deconvoluție captează numărul maxim teoretic de fotoni emiși de probă. Procesul de deconvoluție redistribuie intensitățile „încețoșate” ale fotonilor emiși deasupra și dedesubtul planului focal înapoi în planul original. Astfel, deconvoluția utilizează aproape toate intensitățile de emisie disponibile și oferă un buget optim de lumină, făcând din această tehnică metoda de alegere pentru probele foarte sensibile la lumină.
O variantă a fenomenului de transfer de energie de rezonanță la microscopia cu fluorescență, fluorescența sau transferul de energie de rezonanță Förster (FRET) este utilizată pentru a obține informații cantitative temporale și spațiale despre legarea și interacțiunea proteinelor, lipidelor, enzimelor și acizilor nucleici în celulele vii. FRET poate folosi tehnici fie în stare constantă, fie rezolvate în timp, dar imagistica FRET rezolvată în timp are avantajul cartografierii mai precise a distanțelor donor-acceptor. Un microscop cu fluorescență cu câmp larg standard echipat cu filtre adecvate de excitare și emisie și o cameră sensibilă poate fi utilizat pentru imagistica FRET. Biosenzorii care interpun o proteină sau peptidă sensibilă la mediu între două proteine fluorescente aplicabile FRET sunt în prezent folosiți pe scară largă în biologia celulară. Aceste sonde sunt fotografiate cu ușurință sub microscopie cu fluorescență cu câmp larg utilizând tehnici FRET cu emisie sensibilizată combinate cu analiza ratiometrică. În plus, imagistica spectrală și dezmetecarea liniară folosind microscopia confocală cu scanare laser pot ajuta la monitorizarea fenomenelor FRET în biosenzori și alte aplicații de proteine fluorescente.
Microscopia de imagistică cu fluorescență (FLIM) este o tehnică sofisticată capabilă să înregistreze simultan durata de viață a fluorescenței și locația spațială a unui fluorofor în fiecare locație din imagine. Această metodă oferă un mecanism pentru studierea parametrilor de mediu, cum ar fi pH-ul, concentrația ionică, polaritatea solventului, interacțiunile necovalente, vâscozitatea și tensiunea oxigenului în celulele vii unice și prezintă datele în matrice spațială și temporală. Măsurătorile FLIM ale duratelor de viață ale stării excitate pe scara nanosecunde sunt independente de concentrațiile locale de fluorofor, efectele de fotoalbire și lungimea căii (grosimea eșantionului), dar sunt sensibile la reacțiile de stare excitată, cum ar fi transferul de energie de rezonanță. De fapt, combinarea FLIM cu FRET prin monitorizarea modificărilor pe durata de viață a donatorilor fluorescenți înainte și după transferul de energie prin rezonanță este considerată a fi una dintre cele mai bune modalități de a studia acest fenomen.
Mobilitatea (coeficientul de difuzie transversală) a macromoleculelor marcate fluorescent și a fluoroforilor mici poate fi determinată prin tehnica de recuperare a fluorescenței după fotoalbire (FRAP). În FRAP, o zonă selectată foarte mică (de câțiva micrometri în diametru) este intens iluminată, de obicei cu un laser, pentru a produce fotoalbirea completă a fluoroforului din acea zonă. Rezultatul este o reducere sau anihilare dramatică a fluorescenței. În urma unui puls de fotoalbire, rata și gradul de recuperare a intensității fluorescenței în regiunile albite au fost monitorizate în funcție de timp la intensități scăzute de excitație pentru a genera informații despre cinetica repopulării și recuperării fluoroforilor (Figura 9). FRAP se efectuează de obicei folosind EGFP sau alte proteine fluorescente. Tehnicile de fotoactivare înrudite se bazează pe fluorofori sintetici speciali în cușcă sau pe proteine fluorescente funcționale similare care pot fi activate prin impulsuri scurte de UV sau violet. Fotoactivarea și FRAP pot fi utilizate ca tehnici complementare pentru a determina parametrii de mobilitate.
Într-o tehnică legată de FRAP, numită pierdere de fluorescență după fotoalbire (FLIP), o regiune fluorescentă definită dintr-o celulă vie suferă fotoalbiri repetate prin iradiere intensă. Dacă toți fluoroforii ar fi capabili să difuzeze în zona care este fotoalbită în timpul perioadei de timp măsurate, aceasta ar duce la o pierdere completă a semnalului fluorescent în întreaga celulă. Prin calcularea ratei cu care fluorescența dispare din întreaga celulă, poate fi determinată mobilitatea difuzială a fluoroforului țintă. În plus, FLIP poate identifica cu ușurință locația și natura oricăror bariere de difuzie între compartimentele individuale ale celulelor, cum ar fi bariera dintre soma și axonul unui neuron.
Spectroscopia de corelație de fluorescență (FCS), utilizată în principal în microscopia confocală cu scanare laser sau microscopia multifoton, este o metodă concepută pentru a determina informații cinetice, cum ar fi ratele de reacție chimică, coeficienții de difuzie, tehnicile de greutate moleculară, debit și agregare. În FCS, un volum mic (aproximativ un femtometru; focalizarea limitată de difracție a laserului) este iluminat cu un fascicul laser focalizat pentru a înregistra fluctuațiile de intensitate a autofluorescenței induse de dinamica moleculelor fluorescente în funcție de timp în volumul ocupat de fluorescente. molecule (Fig. 10). Fluoroforele relativ mici difuzează rapid în volumul iluminat, producând explozii scurte de intensitate aleatorie. În schimb, complexele mai mari (fluorofori legați de macromolecule) se mișcă mai lent, producând modele de intensitate a fluorescenței mai lungi și mai persistente, dependente de timp.
Atunci când structurile marcate fluorescent sunt împachetate dens și se suprapun în regiuni specifice ale celulelor vii, dinamica și distribuția lor spațială sunt dificil de analizat. Microscopia spot cu fluorescență (FSM) este o tehnică compatibilă cu aproape toate modalitățile de imagistică care profită de concentrațiile foarte scăzute de subunități marcate fluorescent, reduce fluorescența nefocalizată și îmbunătățește vizibilitatea structurilor marcate și dinamica acestora în regiunile groase. FSM-urile sunt implementate prin etichetarea doar a unei fracțiuni din întreaga structură de interes. În acest sens, FSM este similar cu efectuarea FCS pe întregul câmp vizual, deși pune mai mult accent pe modelele spațiale, mai degrabă decât pe analiza temporală cantitativă. Microscopia spot fluorescent este deosebit de utilă în determinarea mobilității și agregării elementelor citoscheletice, cum ar fi actina și microtubulii din celulele hiperactive.
Microscopia cu epuizare a emisiilor stimulate (STED) este o tehnică emergentă de super-rezoluție cu rezoluție spațială mult peste limita de difracție, folosind lumină epuizată în formă de inel pentru a înconjura un fascicul mai mic de lumină de excitație pentru a obține sub-50 nm pe axă. rezolutia. Tehnica se bazează pe excitarea fluoroforilor cu impulsuri laser sincronizate și impulsuri STED circulare coordonate spațial care epuizează lumina emisă, suprimând fluorescența moleculelor excitate în jurul focarului de scanare laser. Fluorescența generată la periferia spotului este suprimată, dar nu în centrul spotului, reducând astfel în mod semnificativ dimensiunea spotului fluorescent și crescând în mod corespunzător rezoluția. STED s-a dovedit a fi un instrument util pentru detectarea de înaltă rezoluție a celulelor vii. Alte tehnici emergente de super-rezoluție, cum ar fi microscopia de localizare fotoactivată (PALM) și microscopia cu iluminare cu lumină structurată (SIM), vor deveni, de asemenea, instrumente fundamentale pentru imagistica cu celule vii în viitorul apropiat.
Utilizarea crescândă a proteinelor fluorescente codificate genetic și a fluoroforelor sintetice avansate pentru imagistica cu celule vii deschide ușa către noi modalități optice pentru monitorizarea dinamicii temporale și a relațiilor spațiale. Microscopiștii au acum un set complet de instrumente pentru a observa și înregistra datele de imagine ale proceselor celulare care au loc pe o gamă largă de intervale de timp și la rezoluții multiple. Evenimentele mai lente pot fi observate și înregistrate cu ușurință utilizând microscopia confocală cu scanare laser, în timp ce evenimente cinetice mai rapide pot fi obținute folosind tehnologia discului rotativ. În plus, microscopia multifotonă permite imagistica profundă în țesuturi groase, iar tehnicile de reflexie internă totală permit sondarea suprafețelor membranei cu precizie confocală. Metodele avansate de fluorescență, cum ar fi FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM și STED, pot fi utilizate pentru a monitoriza interacțiunile proteină-proteină la rezoluții adesea mai bune decât cele permise de limita de difracție. Odată cu progresele în tehnologie fluorofor, microscop și detector, o lume mai largă va fi adusă „sub microscop”.
