Cunoștințe despre microscopia cu fluorescență cu doi-fotoni
Principiul de bază al excitației cu doi-fotoni este că la o densitate mare de fotoni, moleculele fluorescente pot absorbi simultan doi fotoni cu lungime de undă lungă și pot emite un foton cu lungime de undă mai scurtă după o perioadă scurtă de așa-numita durată de viață în stare excitată; Efectul este același cu utilizarea unui foton cu jumătate din lungimea de undă a lungimii de undă lungă pentru a excita molecule fluorescente. Excitarea cu doi fotoni necesită o densitate mare de fotoni și, pentru a evita deteriorarea celulelor, microscopia cu doi-fotoni utilizează lasere cu impulsuri blocate-mod de înaltă energie-. Laserul emis de acest laser are energie de vârf ridicată și energie medie scăzută, cu o lățime a impulsului de doar 100 de femtosecunde și o frecvență de până la 80 până la 100 megaherți. Când utilizați un obiectiv cu deschidere numerică mare pentru a focaliza fotonii unui laser cu impulsuri, densitatea fotonului la punctul focal al lentilei obiectiv este cea mai mare, iar excitația cu doi-fotoni are loc numai la punctul focal al lentilei obiectiv. Prin urmare, microscopul cu doi-fotoni nu necesită un orificiu confocal, ceea ce îmbunătățește eficiența detectării fluorescenței.
În fenomenele generale de fluorescență, datorită densității scăzute de fotoni a luminii de excitație, o moleculă fluorescentă poate absorbi doar un foton la un moment dat și apoi emite un alt foton fluorescent prin tranziție radiativă, care este cunoscută sub numele de fluorescență cu un singur foton. Pentru procesele de excitare a fluorescenței care utilizează lasere ca surse de lumină, pot apărea fenomene de fluorescență cu doi-fotoni sau chiar multifotoni. În acest caz, sursa de lumină de excitație utilizată are o intensitate mare și o densitate de fotoni care îndeplinește cerințele ca moleculele fluorescente să absoarbă doi fotoni simultan. În procesul de utilizare a unui laser general ca sursă de lumină de excitație, densitatea fotonului este încă insuficientă pentru a produce fenomenul de absorbție a doi-fotoni. În mod obișnuit, se folosesc lasere cu impulsuri femtosecunde, cu puterea instantanee atingând nivelul de megawați. Prin urmare, lungimea de undă a fluorescenței cu doi-fotoni este mai mică decât cea a luminii de excitație, echivalent cu efectul produs de excitația cu jumătate de lungime de undă de excitație.
