Introducere în microscopia cu fluorescență
Microscopia cu fluorescență este de a iradia obiectul colorat cu fluoresceină cu lumină de lungime de undă scurtă, astfel încât să fie excitat pentru a produce fluorescență cu lungime de undă lungă și apoi observat. Într-un microscop cu fluorescență, lumina de excitare a unei anumite lungimi de undă trebuie selectată din lumina de iluminare a specimenului pentru a genera fluorescență, iar apoi fluorescența trebuie separată de lumina mixtă a luminii de excitație și fluorescența pentru observare. Prin urmare, sistemul de filtrare joacă un rol extrem de important în selectarea unei anumite lungimi de undă. Microscoapele cu fluorescență sunt utilizate pe scară largă în biologie, medicină și alte domenii.
1. Principalele componente ale microscopului cu fluorescență:
(A) Sursă de lumină: sursa de lumină radiază lumină de diferite lungimi de undă (de la ultraviolet la infraroșu). cel
(B) Sursă de lumină cu filtru de excitare: prin lumina unei anumite lungimi de undă care poate determina ca specimenul să producă fluorescență, blocând în același timp lumina care este inutilă pentru excitarea fluorescenței. cel
(C) Specimenele fluorescente: în general colorate cu pigmenți fluorescenți. cel
(D) Filtru de blocare: blocați lumina de excitație care nu este absorbită de eșantion și transmite selectiv fluorescența, iar unele lungimi de undă sunt transmise selectiv în fluorescență.
cel
2. Clasificarea microscoapelor cu fluorescență:
Microscoapele cu fluorescență sunt, în general, împărțite în două tipuri: transmisie și epiemisie:
A. Tip de transmisie: lumina de excitație vine din partea de jos a obiectului care trebuie inspectat, iar condensatorul este un condensator de câmp întunecat, astfel încât lumina de excitație să nu intre în lentila obiectivului, dar fluorescența intră în lentila obiectivului. Este luminos la măriri mici, dar întunecat la măriri mari. Este dificil de operat în imersie în ulei și centrare. Este deosebit de dificil să determinați intervalul de iluminare la măriri mici, dar poate obține un fundal de câmp vizual foarte întunecat. Tipul de transmisie nu este utilizat pentru obiecte netransparente. cel
b. Epi-tip: Tipul de transmisie este aproape eliminat în prezent. Majoritatea noilor microscoape cu fluorescență sunt de tip epi. Sursa de lumină vine de deasupra obiectului care urmează să fie inspectat și există un divizor de fascicul în calea optică, astfel încât este potrivită atât pentru obiectele transparente, cât și pentru cele opace de inspectat. Deoarece obiectivul acționează ca o lentilă de condensare, nu numai că este ușor de utilizat, ci și poate obține o iluminare uniformă a întregului câmp vizual, de la mărire scăzută la mărire mare. cel
cel
3. Precauții pentru fluoroscopie
A. Iradierea pe termen lung a luminii de excitație va provoca atenuarea și stingerea fluorescenței, deci scurtați timpul de observare cât mai mult posibil și utilizați o deflector pentru a acoperi lumina de excitare atunci când nu observați temporar. cel
b. Când observați cu o lentilă de imersie în ulei, utilizați „ulei non-fluorescent”. cel
c. Fluorescența este aproape întotdeauna slabă și ar trebui efectuată într-o cameră întunecată. cel
d. Cel mai bine este să instalați un stabilizator de tensiune în sursa de alimentare, în caz contrar, tensiunea instabilă nu numai că va reduce durata de viață a lămpii cu mercur, ci va afecta și efectul inspecției la microscop. cel
cel
4. Utilizarea microscopiei cu fluorescență
1. Cerințe de pregătire pentru specimenele de microscop cu fluorescență
A. Lamelă de sticlă
Grosimea lamei de sticlă trebuie să fie între 0,8 și 1,2 mm. O lamă prea groasă va absorbi mai multă lumină pe de o parte, iar pe de altă parte, lumina de excitație nu poate fi concentrată pe specimen. Lamelele trebuie să fie netede, uniforme ca grosime și fără autofluorescență evidentă. Uneori se folosesc lamele de sticlă de cuarț. cel
b. Sticlă de acoperire
Grosimea geamului de acoperire este de aproximativ 0,17 mm, netedă. Pentru a întări lumina de excitație, se poate folosi și o sticlă de acoperire uscată, care este o sticlă de acoperire specială acoperită cu mai multe straturi de substanțe (cum ar fi fluorură de magneziu) care au efecte de interferență diferite asupra luminii de diferite lungimi de undă, ceea ce poate face ca fluorescența merge fără probleme. Lumina de excitație este trecută prin, iar lumina de excitație reflectată excită specimenul. cel
c. Specimen
Feliile de țesut sau alte specimene nu trebuie să fie prea groase. Dacă este prea gros, cea mai mare parte a luminii de excitație va fi consumată în partea inferioară a specimenului, în timp ce partea superioară observată direct de lentila obiectiv nu poate fi pe deplin excitată. În plus, suprapunerea celulelor sau impuritățile se acoperă, afectând judecata. cel
d. Agent de montaj
Glicerina este folosită în mod obișnuit ca agent de montare, care trebuie să nu aibă autofluorescență, incoloră și transparentă, iar luminozitatea fluorescenței este mai strălucitoare la pH 8.5-9,5 și nu este ușor să se estompeze rapid. Prin urmare, un amestec egal de glicerol și soluție tampon de carbonat de 0,5 mol/L cu un pH de 9,0 până la 9,5 este utilizat în mod obișnuit ca agent de montare. cel
e. ulei de oglindă
În general, uleiul de imersie trebuie utilizat atunci când se observă specimene cu microscoape cu fluorescență cu câmp întunecat și obiective cu imersie în ulei. Cel mai bine este să folosiți ulei special de oglindă nefluorescent, care poate fi înlocuit și cu glicerina menționată mai sus, și poate fi folosită și parafină lichidă, dar indicele de refracție este scăzut, ceea ce afectează ușor calitatea imaginii.
