Metode de imagistică a câmpului-luminos și a câmpului-întunecat în microscopia cu fluorescență
(1) Metoda de imagistică în câmp luminos (BFI), care permite doar fasciculului de electroni transmis în regiunea paraxială să treacă prin deschiderea obiectivului, formând o imagine întunecată pe un fundal luminos. Cu cât deschiderea diafragmei obiectivului este mai mică, cu atât contrastul imaginii câmp luminos este mai mare; (2) Imagistica în câmp întunecat (DFI) este o tehnică care permite doar unei porțiuni din fasciculul împrăștiat cu unghi mare sau unui anumit fascicul de difracție al cristalului să treacă prin deschiderea obiectivului, blocând în același timp fasciculul transmis. Aceasta formează o imagine grafică strălucitoare pe un fundal întunecat. Această metodă de imagistică în câmp întunecat poate îmbunătăți contrastul imaginilor și este o tehnică de imagistică importantă.
Există aproximativ patru metode pentru a obține imagini în câmp întunecat folosind microscoape cu fluorescență Leica: (1) menținerea iluminării verticale de-a lungul axei optice în timp ce se deplasează deschiderea obiectivului; (2) Utilizarea iluminării oblice pentru a capta fascicule împrăștiate în direcția axei optice se numește Central Dark Field Imaging (CDFI); (3) O deschidere a obiectivului cu un opritor central al fasciculului și o zonă circulară transparentă; (4) Utilizați o lentilă de condensare circulară transparentă pentru detectarea luminii și o deschidere circulară centrală pentru obiectiv. Metoda * aici este cea mai simplă, dar folosește imagistica electronică în zona distală a mânecii, deci aberația este mare și calitatea imaginii nu este foarte bună. A doua metodă poate evita dezavantajele de mai sus, dar deschiderea obiectivului microscopului cu fluorescență Leica primește doar o mică parte din electroni difracțiați împrăștiați, rezultând o eficiență mai scăzută. Partea diafragmei este adesea supusă unei cantități mari de bombardament electronic, care poate provoca cu ușurință contaminare asimetrică și poate afecta calitatea imaginii. Lentila obiectiv inelară a fost îmbunătățită în acest aspect, dar dezavantajul este că este dificil de produs și este dificil de realizat o simetrie axială completă. Având în vedere cerințele relativ relaxate pentru sistemul de iluminat, se poate adopta cea din urmă soluție, care implică adăugarea unei deschideri inelare la condensator pentru a asigura iluminarea cu fascicul gol pentru eșantion. Efectul acestui dispozitiv. Rezoluția sa de imagine poate fi apropiată de cea a imaginilor cu câmp luminos, în timp ce contrastul este mult îmbunătățit.
