Microscopia cu fluorescență Parametrii tehnici Tehnici și metode ale microscopiei cu fluorescență
Microscop cu fluorescență Parametri tehnici 1. Ocular cu unghi larg 2. Obiectiv acromatic 3. Convertor lentilă obiectiv cu patru orificii 4. Dispozitiv epifluorescent Albastru (B) Verde (G) Sistem de excitare 10Lampa cu mercur 0W 5. Mecanism coaxial de reglare a focalizării grosiere și fine: reglare Interval de focalizare: 15 mm Valoare grilă de micro-mișcare: 0,002 mm 6. Masă mecanică cu două straturi Interval de mișcare longitudinală: 70 mm Interval de mișcare laterală: 50 mm
Parametrii tehnici ai microscopului cu fluorescență
1. Ocular cu unghi larg
2. Obiectiv acromatic
3. Nasul cu patru deschideri
4. Dispozitiv de epifluorescență albastru (B) verde (G) sistem de excitare lampă cu mercur de 100 W
5. Mecanism coaxial de reglare a focalizării grosiere și fine: interval de focalizare 15 mm valoarea grilei de mișcare fină 0.002 mm
6. Banc de lucru mecanic cu două straturi
Interval de mișcare verticală: 70 mm Interval de mișcare laterală: 50 mm
Abilități și metode de microscopie cu fluorescență
(1) Lamă de sticlă
Grosimea lamei de sticlă trebuie să fie între 0,8 și 1,2 mm. O lamă prea groasă va absorbi mai multă lumină, pe de o parte, iar pe de altă parte, lumina de excitație nu poate fi concentrată pe specimen. Lamele trebuie să fie netede, uniforme ca grosime și fără autofluorescență evidentă. Uneori se folosesc lamele de sticlă de cuarț.
(2) Sticlă de acoperire
Grosimea geamului de acoperire este de aproximativ 0,17 mm, netedă. Pentru a întări lumina de excitație, se poate folosi și o sticlă de acoperire de interferență, care este o sticlă de acoperire specială acoperită cu mai multe straturi de substanțe (cum ar fi fluorură de magneziu) care au efecte de interferență diferite asupra luminii de diferite lungimi de undă, ceea ce poate face ca fluorescența merge fără probleme. Lumina excitantă este trecută și reflectată, iar această lumină de excitație reflectată excită specimenul.
(3) Exemplar
Feliile de țesut sau alte specimene nu trebuie să fie prea groase. Dacă este prea gros, cea mai mare parte a luminii de excitație va fi consumată în partea inferioară a specimenului, în timp ce partea superioară observată direct de lentila obiectiv nu va fi pe deplin excitată. În plus, suprapunerea celulelor sau acoperirea cu impurități afectează judecata.
(4) Agent de montaj
Glicerina este folosită în mod obișnuit ca agent de montare, care trebuie să nu aibă autofluorescență, incoloră și transparentă, iar luminozitatea fluorescenței este mai strălucitoare la pH 8.5-9,5 și nu este ușor să se estompeze rapid. Prin urmare, un amestec egal de glicerol și soluție tampon de carbonat de 0,5 mol/l cu un pH de 9,0 până la 9,5 este utilizat în mod obișnuit ca agent de montare.
(5) ulei de oglindă
În general, atunci când se observă specimene cu microscoape cu fluorescență cu câmp întunecat și lentile cu imersie în ulei, trebuie utilizat ulei de imersie. Cel mai bine este să folosiți ulei special de imersie nefluorescent. În schimb, se poate folosi și glicerina de mai sus și se poate folosi și parafină lichidă, dar indicele de refracție este scăzut, ceea ce are un impact ușor asupra calității imaginii. Influență.
Principiul și caracteristicile structurale ale microscopului cu fluorescență
Microscopia cu fluorescență utilizează un punct cu eficiență luminoasă ridicată pentru a emite lumină cu o anumită lungime de undă (cum ar fi lumina ultravioletă 3650 inchi sau lumină albastră violet 4200 in) prin sistemul de filtrare ca lumină de excitație pentru a excita substanțele fluorescente din specimen pentru a emite fluorescență de diverse culori După aceea, observați prin mărirea obiectivului și a ocularului. În acest fel, sub un fundal de contrast puternic, chiar dacă fluorescența este foarte slabă, este ușor de identificat și are o sensibilitate ridicată. Este utilizat în principal pentru cercetarea structurii și funcției celulare și a compoziției chimice. Structura de bază a unui microscop cu fluorescență este compusă dintr-un microscop optic obișnuit plus unele accesorii (cum ar fi o sursă de lumină fluorescentă, un filtru de excitație, un divizor de fascicul cu două culori și un filtru de blocare etc.). Sursă de lumină fluorescentă—utilizați în general o lampă cu mercur de presiune ultra-înaltă (50-200W), care poate emite lumină de diferite lungimi de undă, dar fiecare substanță fluorescentă are o lungime de undă de excitație care produce cea mai puternică fluorescență, deci un filtru de excitație ( În general, există filtre de excitație ultraviolete, violete, albastre și verzi), care permit doar trecerea luminii de excitație cu o anumită lungime de undă și iradierea specimenului, absorbind în același timp altă lumină. După ce fiecare substanță este iradiată de lumina de excitație, emite fluorescență vizibilă cu o lungime de undă mai mare decât lungimea de undă de iradiere într-un timp foarte scurt. Fluorescența este specifică și în general mai slabă decât lumina de excitație. Pentru a observa fluorescența specifică, blocarea (sau suprimarea) trebuie adăugată în spatele lentilei obiectivului și utilizată împreună cu aceasta.
Diferența dintre microscopul cu fluorescență și microscopul obișnuit
1. Metoda de iluminare este de obicei episcopică, adică sursa de lumină este proiectată pe probă prin lentila obiectivului;
2. Sursa de lumină este lumină ultravioletă, lungimea de undă este mai scurtă și rezoluția este mai mare decât cea a microscoapelor obișnuite;
3. Există două filtre speciale, cel din fața sursei de lumină este folosit pentru a filtra lumina vizibilă, iar cel dintre ocular și lentila obiectiv este folosit pentru a filtra razele ultraviolete pentru a proteja ochiul uman.
Microscopul cu fluorescență este, de asemenea, un fel de microscop optic, principala diferență este că lungimea de undă de excitație a celor două este diferită. Aceasta determină diferența dintre microscopul cu fluorescență și microscopul optic obișnuit în ceea ce privește structura și utilizarea.
Microscopia cu fluorescență este un instrument esențial în citochimia imunofluorescentă. Este compus din componente principale, cum ar fi sursa de lumină, sistemul cu plăci de filtrare și sistemul optic. Este de a folosi o anumită lungime de undă a luminii pentru a excita specimenul să emită fluorescență și pentru a observa imaginea de fluorescență a specimenului prin amplificarea lentilei obiectivului și a sistemului de ocular.
