Îmbunătățirea beneficiilor microscopiei cu scanare laser multifotonice
Microscopia multifotonă cu scanare laser este o îmbunătățire majoră față de microscopia optică. Poate observa structura profundă a celulelor vii, a celulelor fixe și a țesuturilor și poate obține structuri clare și ascuțite cu mai multe straturi în plan Z, adică secțiuni optice, din care poate construi structura solidă tridimensională a specimenului. Microscopia confocală folosește o sursă de lumină laser care, după extindere, umple întregul plan focal din spate al lentilei obiectivului și apoi trece prin sistemul de lentile al lentilei obiectivului pentru a converge într-un punct foarte mic pe planul focal al specimenului. În funcție de deschiderea numerică a obiectivului, diametrul celui mai strălucitor punct de iluminare este de aproximativ 0.25 ~ 0.8μm, iar adâncimea este de aproximativ 0}.5 ~ 1.5μm . Dimensiunea spotului confocal depinde de designul microscopului, lungimea de undă laser, caracteristicile obiectivului, setările de stare a unității de scanare și proprietățile specimenului. Gama de iluminare și adâncimea de iluminare a unui microscop de câmp sunt mari, în timp ce iluminarea unui microscop confocal este concentrată pe o focalizare precisă pe planul focal. Cel mai de bază avantaj al microscopiei confocale este că poate efectua secționarea optică fină a specimenelor fluorescente groase (care pot ajunge la 50 μm sau mai mult), iar grosimea feliilor este de aproximativ 0,5 până la 1,5 μm. Imaginile secțiunii optice în serie pot fi obținute prin deplasarea specimenului în sus și în jos folosind un motor pas cu pas cu axa Z al microscopului sofisticat. Colectarea de informații despre imagine este controlată într-un plan precis, fără a fi interferată de semnale emise din alte locații de pe specimen. După eliminarea influenței fluorescenței de fundal și creșterea raportului semnal-zgomot, contrastul și rezoluția imaginilor confocale sunt îmbunătățite semnificativ în comparație cu imaginile tradiționale cu fluorescență iluminate în câmp. În multe exemplare, multe componente structurale complicate sunt împletite pentru a forma sisteme complexe, dar odată ce se pot colecta suficiente secțiuni optice, le putem reconstrui în trei dimensiuni prin intermediul software-ului. Această metodă experimentală a fost utilizată pe scară largă în cercetarea biologică pentru a elucida relațiile complexe structurale și funcționale dintre celule sau țesuturi.
