Aplicarea conceptului de microscop modern în observarea lumii microscopice
Din cele mai vechi timpuri și până în prezent, ființele umane au urmărit adevăruri mai înalte și mai departe. De la călătoriile oceanice la explorarea spațiului, oamenii au cucerit obiective mari unul după altul. Cu toate acestea, lumea macroscopică pe care oamenii o văd cu ochiul liber nu este lumea întreagă, iar ochiul uman nu o poate vedea clar. De asemenea, atrage nenumărați oameni de explorat și urmărit.
Indiferent de lucrurile macroscopice sau microscopice, observațiile noastre se bazează pe atributele spațiului tridimensional, adică XYZ tridimensional, iar observarea modificărilor formei lucrurilor trebuie să introducă un alt factor de măsurare - timpul T, astfel încât Cel mai complet mod de a observa lucrurile trebuie să fie Înregistrarea simultană a XYZT, adică fotografia pe termen lung a formei plus timp, este, de asemenea, funcția finală a microscopului.
După mai bine de 300 de ani de dezvoltare, microscoapele moderne au propus concepte precum rezoluția, adâncimea câmpului și câmpul vizual și au propus continuu soluții. Microscoapele ne-au satisfăcut inițial nevoile de observare a lumii microscopice și ne-au ajutat să înregistrăm spațiul și timpul lumii microscopice.
Cel mai important lucru în observația microscopică a lumii este rezoluția detaliilor, iar conceptul de rezoluție s-a născut din asta. Rezoluția se referă la distanța minimă dintre două puncte care pot fi distinse de ochiul uman și este valabilă doar în dimensiunea XY. Conform criteriului Rayleigh, Criteriul Rayleigh, limita pe care oamenii normali o pot distinge este de două puncte de 0,2 mm la o distanță de 25 cm. Când folosim un microscop, putem vedea două puncte la o distanță mai mică, ceea ce îmbunătățește rezoluția observației noastre. Odată cu aprofundarea continuă a cercetării moderne, cerințele oamenilor pentru rezoluție sunt, de asemenea, în continuă creștere, iar oamenii de știință îmbunătățesc, de asemenea, în mod constant rezoluția microscoapelor. De exemplu, microscoapele electronice au crescut rezoluția la nivelul nanometrului, permițând observarea virușilor. Tehnologia de imagistică microscopică ultra-înaltă îmbunătățește rezoluția microscopului de la 200 de nanometri la zeci de nanometri, realizând observarea organelelor celulare vii.
Îmbunătățirea rezoluției aduce și noi probleme, adică reducerea câmpului vizual și a adâncimii câmpului. Când se utilizează metoda obișnuită de iluminare centrală (metoda de iluminare fotopică care face ca lumina să treacă uniform prin specimen), distanța de rezoluție a microscopului este d=0.61 λ/NA, intervalul de lungimi de undă a luminii vizibile este { {2}}nm, lungimea medie de undă este de 550 nm, iar lungimea de undă este o constantă fixă. Prin urmare, creșterea valorii NA poate obține o valoare D mai mică, adică distanța dintre două puncte care pot fi distinse Mai mici, permițând oamenilor să vadă în mod clar obiectele mai mici.
Valoarea NA este deschiderea numerică, care descrie dimensiunea unghiului conului de recepție a luminii lentilei, NA=n * sin , adică produsul indicelui de refracție (n) al mediului dintre lentilă și obiectul de inspectat și sinusul jumătății unghiului de deschidere (2 ). n este indicele de refracție la lumină al mediului dintre lentila obiectiv și probă. Când mediul spațiului obiect al microscopului este aer, indicele de refracție n=1. Utilizarea unui mediu cu un indice de refracție mai mare decât aerul poate crește semnificativ valoarea NA. Mediul de imersie în apă este apă distilată, iar indicele de refracție Raportul este de 1,33; Mediul obiectiv de imersie în ulei este ulei de cedru sau alte uleiuri transparente, iar indicele său de refracție este în general în jur de 1,52, care este aproape de indicele de refracție al lentilei și al sticlei de lame. Prin urmare, valoarea NA a lentilei de ulei este mai mare decât cea a lentilei de aer.
Unghiul de deschidere, cunoscut și sub denumirea de „unghiul gurii oglinzii”, este unghiul format de punctul obiectului de pe axa optică a lentilei și diametrul efectiv al lentilei frontale a obiectivului. Creșterea unghiului gurii oglinzii poate crește valoarea sinusului, iar limita sa superioară reală este de aproximativ 72 de grade (valoarea sinusului este 0.95), înmulțită cu indicele de refracție al uleiului de cedru 1,52, se poate obține că valoarea maximă a NA este de aproximativ 1,45 și, înlocuită în formula de calcul a rezoluției, se poate obține că rezoluția limită în plan XY a unui microscop convențional este de aproximativ 0.2um.
Valoarea NA afectează direct luminozitatea câmpului vizual al microscopului (B). Din formula B∝NA2/M2 putem deduce că luminozitatea crește odată cu creșterea diafragmei numerice (NA) sau scăderea măririi obiectivului (M).
Teoretic, ar trebui să urmărim cea mai mare valoare NA posibilă pentru a obține o rezoluție mai bună a planului XY și luminozitate a câmpului vizual. Totuși, totul are două laturi. Îmbunătățirea rezoluției planului XY va reduce adâncimea de câmp a axei Z și câmpul vizual de observare.
Microscoapele privesc în general vederea vertical în jos. Când poziția convexă și poziția concavă pe suprafața obiectului observate în diametrul câmpului vizual pot fi văzute clar, atunci diferența de înălțime dintre punctul convex și punctul concav este adâncimea câmpului. Ei bine, pentru microscoape, cu cât adâncimea câmpului este mai mare, cu atât mai bine. Cu cât adâncimea câmpului este mai mare, cu atât se pot obține imagini mai bune și mai clare tridimensionale atunci când se observă suprafața obiectelor neuniforme. Adâncimea mare de câmp ne ajută să observăm lumea microscopică în direcția verticală. Adică, informațiile pe axa Z în forma tridimensională XYZ.
Adâncimea câmpului este adâncimea spațiului din față și din spate corespunzătoare imaginii clare din planul imaginii: dtot=(λ*n)/NA plus n/(M∗NA) * e, dtot: adâncimea câmpului , NA: deschidere numerică, M: Mărire totală, λ: lungime de undă a luminii, (de obicei λ=0.55um), n: indicele de refracție al mediului dintre eșantion și lentila obiectiv (aer: n{{3 }}, ulei: n=1.52) Conform acestei formule, putem ști că adâncimea de câmp a axei Z este invers proporțională cu valoarea NA din planul XY.
Pe lângă adâncimea câmpului, câmpul vizual este afectat și de valoarea NA. Intervalul spațial care poate fi văzut atunci când instrumentul privește fix un punct este câmpul vizual. Calculul său este direct legat de mărirea lentilei obiectivului. Diametrul real al câmpului vizual văzut prin observare este egal cu diametrul câmpului vizual Împărțit la mărirea lentilei obiectivului, ocularul va indica câmpul vizual corespunzător, cum ar fi 10/18, adică mărirea este de 10 ori, iar diametrul câmpului vizual este de 18 mm. Prin urmare, atunci când ocularul este determinat, cu cât mărirea este mai mare, cu atât câmpul vizual observat este mai mic.
Rezoluția planului XY este analiza detaliilor locale, iar câmpul vizual determină intervalul nostru de observare al eșantionului. Cu cât câmpul vizual este mai mare, cu atât mai bine, dar limitat de tehnologia actuală, trebuie să folosim obiective de mare putere pentru a obține valori bune NA, prin urmare, câmpul vizual și valorile NA au o corelație negativă indirectă.
