Microscopie confocală cu laser - Caracteristici și aplicații
Microscopia confocală cu scanare cu laser (LSCM) este un tip de microscop proiectat pe baza tehnologiei de focalizare conjugată, adică sursa de lumină laser, proba de măsurat și detectorul sunt toate în poziții conjugate unul cu celălalt.
Fundamental
Într-un microscop general, planul de observație al imaginii este izolat de planul axial adiacent prin coinciderea planului focal al lentilei obiectiv cu detectorul, în timp ce într-un microscop confocal, un punct de lumină cu difracție limitată este utilizat pentru a ilumina proba și A pinhole este utilizat în calea luminii colectate la focarul conjugat al punctului de lumină pentru a filtra lumina parazită pentru a crea acest efect de izolare și, prin urmare, a îmbunătăți rezoluția.
Caracteristici de imagistică
Imagistica de scanare a secțiunii optice
O altă caracteristică a microscopiei confocale cu scanare cu laser este că este o tehnologie de scanare a imaginii. Tehnologia tradițională de iluminare cu câmp larg luminează întregul eșantion, astfel încât imaginea poate fi captată direct cu ochiul liber sau cu un detector, dar LSCM folosește un fascicul sau mai multe fascicule focalizate trec prin eșantion pentru a scana și imagine. Imaginea rezultată se numește secțiune optică. Următoarele arată diferența dintre metoda tradițională de iluminare cu câmp larg și metoda de iluminare confocală cu scanare laser.
Prin urmare, o metodă reală de lucru a unui microscop confocal modern este cea prezentată în figura de mai jos. Lumina de excitație emisă de laser trece printr-o oglindă dicroică și este scanată în direcția x și direcția y a probei printr-o pereche de galvanometre. Excitația (sau reflexia) eșantionului este. Lumina intră în detectorul PMT prin gaură și este înregistrată, iar imaginea scanată înregistrată este reconstruită de un computer pentru a reconstrui imaginea eșantionului real.
Generați imagini „z-stack” pe diferite planuri focale
Doar lumina reflectată înapoi din stratul de probă conjugat poate trece prin gaura mică din calea luminii de colectare, iar reflexiile rămase irelevante ale stratului de probă sunt blocate de orificiul mic. Acest lucru poate duce la îmbunătățiri semnificative ale rezoluției. Comparație alăturată a microscopiei cu fluorescență multidimensională și microscopiei confocale a aceleiași probe groase. Atunci când o serie de imagini sunt luate la diferite planuri focale, pot fi generate imagini denumite în mod obișnuit „z-stacks”, care ilustrează câștigurile de rezoluție și contrast oferite de microscopia confocală și cauzele care stau la baza acestor câștiguri. Se poate observa că examinarea imaginii din partea de sus a stivei cu planul de imagistică deasupra țesutului dezvăluie o cantitate mare de lumină împrăștiată în imaginea cu fluorescență, în timp ce imaginea microscopică confocală apare neagră. Această reducere a PSF axial are drept rezultat diferența de rezoluție observată la interfața optică din mijlocul stivei z.
Rezoluția este mult îmbunătățită în comparație cu iluminarea cu câmp larg
În microscopia cu fluorescență, intensitatea luminii emisă dintr-un singur punct este descrisă de funcția de răspândire a punctelor (PSF), iar modelul său este un disc Airy. Rezoluția sistemului de fluorescență poate fi descrisă de raza discului Airy, care poate fi descrisă prin Deschiderea numerică a lentilei obiectiv și lungimea de undă a luminii de excitație determină
