Ce este microscopia cu fluorescență cu doi fotoni
Principiul de bază al excitației cu doi fotoni este: în cazul unei densități mari de fotoni, moleculele fluorescente pot absorbi doi fotoni cu lungime de undă lungă în același timp și pot emite un foton cu lungime de undă mai scurtă după o perioadă scurtă de așa-numita durată de viață a stării excitate. . ; efectul este același cu utilizarea unui foton a cărui lungime de undă este jumătate din lungimea de undă lungă pentru a excita o moleculă fluorescentă. Excitația cu doi fotoni necesită o densitate mare de fotoni. Pentru a nu deteriora celulele, microscopia cu doi fotoni folosește lasere pulsate blocate în mod de înaltă energie. Laserul emis de acest laser are energie de vârf ridicată și energie medie scăzută, lățimea impulsului său este de doar 100 femtosecunde, iar frecvența sa poate ajunge la 80 până la 100 megaherți. Când utilizați o lentilă obiectiv cu deschidere numerică mare pentru a focaliza fotonii laserului pulsat, densitatea fotonului la punctul focal al lentilei obiectiv este cea mai mare, iar excitația cu doi fotoni are loc numai la punctul focal al lentilei obiectiv, deci microscopul cu doi fotoni nu are nevoie de un orificiu confocal, ceea ce îmbunătățește eficiența detectării fluorescenței.
În fenomenele generale de fluorescență, datorită densității scăzute de fotoni a luminii de excitație, o moleculă fluorescentă poate absorbi doar un foton în același timp și apoi emite un foton fluorescent printr-o tranziție radiativă, care este fluorescența cu un singur foton. Pentru procesul de excitare a fluorescenței folosind laserul ca sursă de lumină, poate apărea fluorescența cu doi fotoni sau chiar multi-fotoni. În acest moment, intensitatea sursei de lumină de excitație utilizată este mare, iar densitatea fotonului îndeplinește cerințele moleculelor fluorescente care absorb doi fotoni în același timp. În procesul de utilizare a unui laser general ca sursă de lumină de excitație, densitatea fotonului nu este încă suficientă pentru a produce fenomenul de absorbție cu doi fotoni. De obicei, se folosește un laser cu impulsuri femtosecunde, iar puterea sa instantanee poate ajunge de ordinul megawaților. Prin urmare, lungimea de undă a fluorescenței cu doi fotoni este mai mică decât lungimea de undă a luminii de excitație, ceea ce este echivalent cu efectul produs de excitație la jumătate din lungimea de undă de excitație.
