Microscopia cu fluorescență cu doi fotoni are multe avantaje:
1) Lungimile de undă mai lungi ale luminii sunt mai puțin afectate de împrăștiere decât lungimile de undă mai scurte ale luminii pentru a pătrunde în specimen;
(2) Moleculele fluorescente din afara planului focal nu sunt excitate, astfel încât mai multă lumină de excitare să poată ajunge în planul focal, astfel încât lumina de excitație să poată pătrunde mai adânc în specimen;
3) Lungimile de undă mai lungi ale luminii în infraroșu apropiat sunt mai puțin toxice pentru celule decât lungimile de undă mai scurte;
4) Când se utilizează un microscop cu doi fotoni pentru a observa un specimen, fotoalbirea și fototoxicitatea sunt prezente numai la planul focal. Prin urmare, microscoapele cu doi fotoni sunt mai potrivite decât microscoapele cu un singur foton pentru observarea specimenelor groase, pentru observarea celulelor vii sau pentru efectuarea experimentelor de fotoalbire spot.
Cunoașterea microscopului confocal cu fluorescență
Principiul de bază al microscopului cu fluorescență confocal: o sursă de lumină punctuală este utilizată pentru a iradia specimenul, formând un punct de lumină mic, bine definit pe planul focal. Fluorescența emisă din acest punct după iradiere este colectată de lentila obiectiv și trimisă înapoi la divizorul de fascicul constând dintr-o oglindă cromatică bidirecțională de-a lungul căii luminii de iradiere inițiale. Divizorul de fascicul trimite fluorescența direct la detector. Atât sursa de lumină, cât și detectorul au fiecare câte un orificiu în fața lor, numit orificiu de iluminare și, respectiv, orificiul de detecție. Ambele au aceeași geometrie, aproximativ 100-200 nm, și sunt conjugate în raport cu punctul de lumină din planul focal, adică punctul de lumină trece printr-o serie de lentile și poate fi focalizat în cele din urmă atât asupra luminii. și găuri de detector. În acest fel, lumina din planul focal poate converge în interiorul deschiderii sondei, în timp ce lumina împrăștiată de deasupra sau dedesubtul planului focal este blocată în afara deschiderii sondei și nu poate fi fotografiată. Laserul scanează eșantionul punct cu punct, iar tubul fotomultiplicator, după detectarea orificiului, obține, de asemenea, imaginea confocală a punctului cu punct de lumină corespunzător, care este convertită într-un semnal digital și transmisă computerului și, în final, converge într-un clar imaginea confocală a întregului plan focal de pe ecran.
Fiecare imagine în plan focal este de fapt o secțiune transversală optică a specimenului, iar această secțiune transversală optică are întotdeauna o anumită grosime, cunoscută și sub numele de foaie optică. Deoarece intensitatea luminii la punctul focal este mult mai mare decât cea a punctului non-focal, iar lumina planului non-focal este filtrată de orificiu, adâncimea de câmp a sistemului confocal este aproximată a fi zero, iar scanarea de-a lungul direcției axei Z permite tomografiei optice să formeze o secțiune optică bidimensională a specimenului care urmează să fie observat la punctul focal. Combinând scanarea în plan XY (plan focal) cu scanarea pe axa Z (axa optică), o imagine tridimensională a probei poate fi obținută prin acumularea de straturi succesive de imagini bidimensionale, care sunt procesate de un software de calculator specializat.
Aceasta înseamnă că orificiul de detectare și orificiul de lumină sunt întotdeauna focalizate în același punct, astfel încât fluorescența excitată în afara planului focal nu poate intra în orificiul de detectare.
Principiul de funcționare al laserului confocal este pur și simplu exprimat că folosește laserul ca sursă de lumină, pe baza imaginilor tradiționale cu microscopul cu fluorescență, a dispozitivului suplimentar de scanare cu laser și a dispozitivului de focalizare conjugat, prin controlul computerului pentru a realiza un sistem de achiziție și procesare a imaginilor digitale.
