Diferența dintre contrastul de fază pozitiv și negativ la microscop
În funcție de configurația și natura inelului de fază poziționat la planul focal din spate al obiectivului, eșantioanele pot fi observate în contrast de fază pozitiv sau negativ. Acest tutorial interactiv studiază relația dintre surround (S), difracție (D) și particulele luminoase rezultate (unde P), precum și microscopia de contrast de fază pozitivă și negativă. În plus, sunt prezentate și geometria plăcii de fază și imagini reprezentative ale eșantionului.
Când oamenii îl folosesc acum în munca lor, majoritatea cercetătorilor sunt în diferența negativă, iar acum diferența pozitivă nu joacă un rol prea mare în activitatea curentă de cercetare științifică.
Tutorialul inițializează imaginea de fază cu un eșantion selectat aleatoriu care apare în fereastra Phase Contrast Image, iar relația de undă corespunzătoare este afișată în vecinul din stânga ferestrei imaginii. Pentru a opera tutorialul, utilizați cursorul mouse-ului pentru a muta translația între contrastul de fază pozitiv și negativ sau glisorul modului de contrast de fază de iluminare puternică. Când glisorul este tradus, imaginile care apar în fereastra de imagine cu contrast de fază modifică modul în care apare specimenul în modul de imagine curent setat de glisor. De asemenea, sub graficul formei de undă se află o placă de fază care își schimbă forma pentru a se potrivi cu modul de imagine selectat de glisor. Pentru a vizualiza o nouă mostră, utilizați meniul derulant Selected Sample pentru a selecta un alt eșantion.
Un grafic al configurației plăcii de fază, a relațiilor de unde și a vectorilor asociați cu generarea de imagini de contrast de fază pozitive și negative este prezentat în Figura 1. Sunt prezentate, de asemenea, exemple de specimene fotografiate prin aceste tehnici. Într-o configurație optică cu contrast de fază pozitiv (rândul superior al imaginii din Figura 1), frontul de undă înconjurător (S) trece prin placa de fază, rezultând o schimbare netă de fază de 180 de grade avans de fază, cu 1/4 lungime de undă ( 1 jumătate de lungime de undă). Fronturile de undă surround avansate sunt acum capabile să participe la interferența distructivă cu undele difractate (D) în planul intermediar al imaginii. În cele mai multe cazuri, simpla avansare a fazei relative a frontului de undă din jur nu este suficientă pentru a avea ca rezultat generarea de imagini cu contrast ridicat în microscoapele Nikon. Acest lucru se datorează faptului că amplitudinea undelor surround este semnificativ mai mare decât cea a undelor difractate și suprimă imaginea rezultată produsă de interferența dintr-o fracțiune din numărul total de unde. Pentru a reduce frontul de undă înconjurător la o valoare mai apropiată de amplitudinea undelor difractate (și a realiza interferențe în planul imaginii), opacitatea în inelul de fază al obiectivului se obține prin aplicarea unui metal semitransparent (densitate crescătoare neutră). ) acoperire Pardoseală. Undele luminoase din jur, care trec aproape complet prin inelul de fază prin proiectare, sub microscopia cu contrast de fază, sunt reduse semnificativ în amplitudine de opacitatea plăcii de fază la o valoare în intervalul de 10 până la 30% din intensitatea originală.
Deoarece unda de particule rezultată este produsă de interferența* fronturilor de undă înconjurătoare și difractate, amplitudinea undei particulei (P) produsă de interferența dintre fronturile de undă care sosesc în planul imaginii este acum mult mai mică decât cea înconjurătoare atunci când se află în modul sexual. strat de densitate aplicat. Efectul net este de a converti diferența de fază relativă introdusă de trecerea luminii care iese din planul imaginii prin specimen într-o diferență de amplitudine (intensitate). Deoarece ochiul uman va interpreta diferența de intensitate ca un contrast, specimenul este acum vizibil în ocularul microscopului și poate fi capturat și pe membrană cu sisteme convenționale de cameră sau digital, folosind dispozitive CCD sau CMOS. Toate sistemele de contrast de fază pozitivă avansează selectiv faza frontului de undă liniar surround (S) în raport cu frontul de undă sferic difractat (D). Specimenele cu un indice de refracție mai mare decât mediul înconjurător apar mai întunecate pe un fundal gri neutru, în timp ce cele cu un indice de refracție mai mic decât mediul de înot apar mai luminoase decât fundalul gri.
Pentru a modifica separarea spațială a fronturilor de undă difractate care înconjoară faza și amplitudinea într-un sistem optic cu contrast de fază, au fost introduse o serie de configurații de plăci de fază. Deoarece placa de fază este situată la sau foarte aproape de planul focal posterior al obiectivului (planul de difracție), toată lumina care trece prin microscop trebuie să călătorească prin această componentă. Partea plăcii de fază din focarul său inelar al condensatorului se numește regiunea conjugată, în timp ce regiunea rămasă se numește regiunea complementară. Regiunea conjugată conține materialul responsabil pentru schimbarea fazei luminii înconjurătoare (nedifractate) fie cu plus, fie cu minus 90 de grade în raport cu frontul de undă difractat. În general, aria inelului conjugat de fază este mai largă (aproximativ 25 la sută) decât aria definită de imaginea inelului de condensare pentru a reduce cantitatea de lumină înconjurătoare care se propagă în zona complementară.
Majoritatea plăcilor de fază disponibile de la producătorii moderni de microscoape sunt una dintre cele preparate prin depunerea în vid a unor filme subțiri dielectrice și metalice pe o placă de sticlă sau montate direct pe suprafața lentilei obiectivului microscopului. Rolul filmului dielectric este de a faza lumina, in timp ce pelicula metalica atenueaza intensitatea luminii nedifractate. Unii producători folosesc mai multe acoperiri anti-reflex, combinate cu filmul pentru a reduce cantitatea de strălucire și reflectarea luminii rătăcite înapoi în sistemul optic. Dacă placa de fază nu se formează pe suprafața unei lentile, aceasta este de obicei cimentată între lentile succesive care se află pe planul focal din spatele obiectivului. Grosimea și indicele de refracție al straturilor dielectrice, metalice și antireflex, precum și cele ale cimentului optic, sunt alese cu grijă pentru a produce defazajul dorit între regiunile complementare și conjugate ale plăcii de fază. În termeni optici, o placă de fază care schimbă faza în raport cu lumina înconjurătoare pentru a difracta lumina cu 90 de grade (fie pozitivă sau negativă) este numită placă cu un sfert de undă din cauza efectului de diferență a căii optice asupra acesteia.
O privire de ansamblu asupra fazei inverse a fazei pozitive este prezentată în figura 1. Placa de contrast cu fază pozitivă (partea stângă a figurii 1) propulsează unda înconjurătoare, cu 1/4 lungime de undă, datorită inelului de eroziune din placa de sticlă, care poate fie redusă de trecerea superioară în placa cu indice înalt Calea fizică a valului luată. Datorită interacțiunii cu proba, atunci când razele eșantionului difractat (D) sunt întârziate, diferența de cale optică între undele înconjurătoare și undele difractate care ies din placa de fază este jumătate din lungimea de undă cu 1/4 lungime de undă. Rezultatul net este o diferență de cale optică de 180-grade între undele înconjurătoare și undele difractate, ceea ce are ca rezultat interferență distructivă pentru probele cu indice de refracție ridicat între planurile imaginii. Curba de amplitudine pentru faza pozitivă opusă undei de interferență distructivă este prezentată în graficul superior al figurii 1. Unda rezultată a particulei (P) are o amplitudine mai mică decât unda înconjurătoare (S), făcând astfel obiectul să apară în comparație cu o fundal mai întunecat. Jos, imaginea algelor verzi Zygnema prezentată în dreapta (etichetată DL). Vectorul reprezentat de progresul lungimii de undă de 1/4, care este prezentat ca o undă surround rotativă în sens invers acelor de ceasornic de 90-grad, în contrast de fază pozitiv, apare între figură și imaginea din Figura 1.
Alternativ, optica microscopului poate fi, de asemenea, fabricată pentru a produce o fază negativă opusă, așa cum se arată în partea inferioară a figurii 1, caz în care undele surround (S) sunt întârziate (mai degrabă decât ca avansate) cu un sfert de lungime de undă relativ la unda difractată (D). Ca rezultat, specimenele cu indici mari de refracție par mai luminoase pe un fundal gri mai închis (vezi imaginea de jos etichetată BM în Figura 1). În faza negativă opusă, placa de fază obiectiv conține un inel ridicat care întârzie faza (în loc să avanseze faza ca faza pozitivă opusă), trecând un sfert de lungime de undă în raport cu faza undei difractate ca undă surround de ordinul zero. Deoarece undele difractate au fost întârziate cu un sfert de lungime de undă pe măsură ce trec prin specimen, diferența de cale optică dintre undele înconjurătoare și cele difractate este eliminată, iar proba cu indice de refracție ridicat interferează constructiv în planul imaginii. Rețineți că unda rezultată a particulei (P) este mai mare ca amplitudine decât unda surround (S) în contrast de fază negativ. De asemenea, este prezentată o fază inversă negativă, în care vectorul de undă de circumnavigație trece printr-o rotație de 90 de grade în sensul acelor de ceasornic a diagramei vectoriale.
