Caracteristicile tehnice și abilitățile de utilizare ale microscopului cu fluorescență cu doi fotoni
Microscopia cu fluorescență cu doi fotoni este o nouă tehnologie care combină microscopia confocală cu scanare cu laser și tehnologia excitației cu doi fotoni.
Principiul de bază al excitației cu doi fotoni este: în cazul unei densități mari de fotoni, moleculele fluorescente pot absorbi doi fotoni cu lungime de undă lungă în același timp și pot emite un foton cu lungime de undă mai scurtă după o perioadă scurtă de așa-numita durată de viață a stării excitate. . ; Efectul este același cu utilizarea unui foton cu o lungime de undă jumătate din lungimea de undă lungă pentru a excita o moleculă fluorescentă. Excitația cu doi fotoni necesită o densitate mare de fotoni. Pentru a nu deteriora celulele, microscopia cu doi fotoni folosește lasere pulsate blocate în mod de înaltă energie. Laserul emis de acest laser are energie de vârf ridicată și energie medie scăzută, lățimea impulsului său este de numai 100 de femtosecunde, iar perioada sa poate ajunge la 80 până la 100 megaherți. Când utilizați o lentilă obiectiv cu deschidere numerică mare pentru a focaliza fotonii laserului pulsat, densitatea fotonului la punctul focal al lentilei obiectiv este cea mai mare, iar excitația cu doi fotoni are loc numai la punctul focal al lentilei obiectiv, deci microscopul cu doi fotoni nu are nevoie de un orificiu confocal, ceea ce îmbunătățește eficiența detectării fluorescenței. Este o metodă de cercetare importantă în domeniile morfologiei, biologiei celulare moleculare, neuroștiinței și farmacologiei.
1. Fundalul apariției microscopiei cu doi fotoni - două limitări ale microscopiei confocale laser tradiționale:
1) Unul este fenomenul de fototoxicitate: deoarece orificiul confocal trebuie să fie suficient de mic pentru a obține o imagine de înaltă rezoluție, iar deschiderea mică va bloca o mare parte din fluorescența emisă de probă, inclusiv fluorescența emisă din planul focal, Da corespunzătoare, lumina de excitație trebuie să fie suficient de puternică pentru a obține un raport semnal-zgomot suficient; iar laserul de mare intensitate va face ca colorantul fluorescent să se estompeze rapid în timpul scanării continue, iar semnalul fluorescent va deveni din ce în ce mai slab pe măsură ce scanarea avansează.
2) Fototoxicitatea este o altă problemă. Sub iradiere cu laser, multe molecule de colorant fluorescent vor produce citotoxine, cum ar fi oxigenul singlet sau radicalii liberi, astfel încât timpul de scanare și densitatea de putere optică a luminii de excitare ar trebui limitate în experiment pentru a menține densitatea probei. activ. În cercetările asupra probelor active, în special în diferitele etape ale creșterii și dezvoltării probelor active, fotoalbirea și fototoxicitatea fac ca aceste studii să fie foarte limitate.
2. De ce spuneți că microscoapele cu doi fotoni, în general, nu trebuie echipate cu lasere cu excitație ultravioletă?
Microscopia cu doi fotoni este o tehnologie de excitație a fluorescenței bazată pe efectul de excitare a doi fotoni: moleculele de colorant fluorescent pot fi excitate prin absorbția a doi fotoni de energie scăzută în același timp (intervalul de timp dintre doi fotoni care ajung la molecule fluorescente este mai mic de 1 femtosecundă ), efectul său de excitare poate fi echivalent cu absorbția unui foton de înaltă energie de 1/2 lungime de undă. De exemplu, absorbția a doi fotoni la lungimi de undă roșii este echivalentă cu o moleculă care absoarbe ultravioletele. Fotonii cu lungime de undă lungă nu sunt absorbiți cu ușurință de către celule, astfel încât fototoxicitatea pentru celulele vii este redusă și foto-albirea este, de asemenea, redusă. În acest fel, nu joacă doar funcția de excitare ultravioletă, dar evită și deteriorarea probei de lumină ultravioletă.
3. Ce este special la laserul microscopului cu doi fotoni?
Probabilitatea de absorbție a doi fotoni depinde de cât de aproape coincid cei doi fotoni incidenti în spațiu și timp (cei doi fotoni trebuie să ajungă în 10-18 secunde). Secțiunea transversală de absorbție a doi fotoni este mică și numai fluoroforii din regiunile cu un flux de fotoni mare sunt excitați. Prin urmare, majoritatea laserelor utilizate sunt lasere cu safir de titan, care pot atinge viteze de scanare în picosecundă sau femtosecundă și au putere de vârf foarte mare și putere medie scăzută, astfel încât fotoalbirea și fototoxicitatea pot fi reduse sau eliminate. Cel mai important lucru este de a asigura o densitate foarte mare de fotoni într-un interval mic, care poate asigura excitarea simultană a doi fotoni.
4. Care sunt avantajele excitației cu doi fotoni?
1) Creșteți selectivitatea colorantului: domeniul luminii de excitare a laserului sistemului confocal (Ar, Ar/Kr, HeNe) este de 488 nm - 647nm. Aceasta înseamnă experimentarea cu coloranți fluorescenți excitați cu UV, de exemplu cu DAPI, Hoescht. Lungimea de undă de excitație a doi fotoni este de două ori mai mare decât a unui singur foton, astfel încât coloranții excitați de ultraviolete pot fi excitați de lumina infraroșie apropiată.
2) Reduceți foto-albirea: Din cauza reducerii foto-albirii, rata de succes a experimentelor care utilizează CFP/YFP pentru transferul de energie prin rezonanță fluorescentă (FRET) crește.
3) Nu este necesară nicio lentilă obiectivă specială: din punct de vedere hardware, excitarea coloranților excitați cu UV cu lungimea de undă a luminii infraroșii apropiate nu necesită componente optice UV speciale.
4) Îmbunătățiți raportul semnal-zgomot: lungimea de undă a luminii de excitație și lungimea de undă a luminii emise au o diferență mare, ceea ce îmbunătățește raportul semnal-zgomot.
5) Albirea localizată la punctul focal: Deoarece excitația fluorescenței are loc numai la punctul focal al obiectivului, nu este nevoie de un orificiu confocal. Acest lucru îmbunătățește detectarea luminii și fotoalbirea are loc numai la punctul focal.
6) Mai ușor de pătruns în specimene: Lumina cu lungimea de undă în infraroșu nu este ușor împrăștiată de celule și poate pătrunde în specimene mai adânci.
5. În comparație cu microscopia confocală cu scanare laser, care este cea mai mare îmbunătățire realizată de microscopia cu doi fotoni?
1) Fotoalbire redusă.
2) Fototoxicitate redusă.
3) Nu este ușor de împrăștiat și este mai ușor să pătrunzi în probe groase, cum ar fi feliile de creier.
