Principiile microscopiei confocale
Microscopul confocal este un instrument de imagistică de înaltă precizie care a apărut și s-a dezvoltat în anii 1980 și este un instrument esențial de cercetare științifică pentru studiul structurilor submicronice. Odată cu dezvoltarea computerelor, a software-ului de procesare a imaginilor și a laserelor, microscoapele confocale au suferit, de asemenea, o mare dezvoltare și sunt acum utilizate pe scară largă în domeniile biologiei, microsistemelor și măsurării materialelor. Microscopul confocal este un nou tip de microscop care integrează principiul confocal, tehnologia de scanare și tehnologia de procesare a graficii pe computer. Principalele sale avantaje sunt: rezoluție laterală mare și rezoluție axială ridicată și suprimarea eficientă a luminii parazite, cu contrast ridicat.
O configurație tipică de microscop confocal este de a plasa două găuri mici pe planul conjugat al planului focal al obiectului măsurat, dintre care unul este plasat în fața sursei de lumină, iar celălalt este plasat în fața detectorului, așa cum se arată în figură. 1. Din figură se poate observa că atunci când proba măsurată se află în planul cvasi-focalizat, intensitatea luminii colectată de capătul de detecție este cea mai mare; când proba măsurată este în poziția defocalizată, punctul luminos de la capătul de detectare difuzează și intensitatea luminii scade rapid. Prin urmare, doar lumina emisă de punctele din planul focal poate trece prin orificiul de ieșire, în timp ce lumina emisă de punctele din afara planului focal este defocalizată pe planul orificiului de ieșire și majoritatea nu pot trece prin orificiul central. Prin urmare, punctul țintă de observare de pe planul focal apare strălucitor, iar punctul de non-observare apare negru ca fundal, mărind contrastul și ștergând imaginea. În timpul procesului de imagistică, cele două găuri sunt confocale, punctul confocal este punctul detectat, iar planul în care se află punctul detectat este planul confocal.
Mărimea găurii de la detector în microscopia confocală joacă un rol critic. Afectează direct rezoluția și raportul semnal-zgomot al sistemului. Dacă orificiul este prea mare, efectul de detectare confocal nu va fi atins, ceea ce nu numai că reduce rezoluția sistemului, dar introduce și mai multă lumină parazită; dacă orificiul este prea mic, va reduce eficiența detectării și va reduce imaginea microscopică. luminozitatea. Studiile au arătat că atunci când diametrul orificiului este egal cu diametrul discului Airy, cerințele confocale sunt îndeplinite, iar eficiența detectării nu este redusă semnificativ. Deoarece diametrul orificiului este, în general, de ordinul micronilor, dacă există o abatere între punctul de focalizare al fasciculului laser și poziția orificiului, va apărea o distorsiune a semnalului. Prin urmare, microscoapele confocale folosesc în general un sistem de focalizare automată, care practic mărește timpul de măsurare.
Deoarece microscopul de scanare confocal laser este o imagine punctuală, pentru a obține o imagine bidimensională a obiectului, este necesar să se utilizeze scanarea bidimensională în direcțiile x și y. Diferite microscoape folosesc diferite metode de scanare:
(1) Scanarea obiectelor. Adică obiectul în sine se mișcă după o anumită lege, în timp ce fasciculul de lumină rămâne neschimbat. Avantaje: cale optică stabilă; Dezavantaje: este necesară o masă mare de scanare, astfel încât viteza de scanare este foarte limitată.
(2) Un sistem de scanare cu fascicul este format prin utilizarea unui galvanometru reflectorizant. Adică, prin controlul galvanometrului de scanare, punctul de lumină focalizat este reflectat în mod regulat către un anumit strat al obiectului pentru a finaliza scanarea bidimensională. Avantajul său este că are o precizie ridicată și este adesea folosit pentru măsurarea de înaltă precizie. Viteza de scanare s-a îmbunătățit față de scanarea obiectelor, dar încă nu este rapidă.
(3) Utilizați elementul de deviere acusto-optic pentru scanare, iar scanarea se realizează prin schimbarea frecvenței de ieșire a undei sonore și apoi prin schimbarea direcției de transmisie a undei luminoase. Avantajul său remarcabil este că viteza de scanare este foarte rapidă. Sistemul de scanare dezvoltat de Statele Unite folosește un deflector acusto-optic pentru a genera imagini video în timp real. Este nevoie de doar 1/30 de secunde pentru a scana o imagine bidimensională și aproape obține rezultate în timp real.
(4) Scanarea discului Nipkow. Procesul de scanare este finalizat prin rotirea discului Nipkow, păstrând celelalte componente nemișcate. Poate fi fotografiat odată și viteza este foarte rapidă. Cu toate acestea, deoarece fasciculul de imagini este lumină în afara axei, aberația în afara axei lentilei trebuie corectată, iar rata de utilizare a energiei luminoase este foarte scăzută.
