Proprietățile optice ale microscoapelor biologice
Performanța optică a microscopului este determinată de următorii opt parametri optici de bază (sau parametri):
(1) Diafragma numerică
Diafragma numerică se mai numește și raport de oglindă. Se referă la produsul indicelui de refracție n al mediului dintre obiectul observat și lentilă și valoarea sinusului a jumătate din unghiul obiectivului. Folosiți NA sau A. pentru a reprezenta. NA=nsin( /2)
Așa-numitul unghi al gurii oglinzii se referă la unghiul dintre razele marginale ale punctului observat care intră în lentila frontală a lentilei obiectiv.
Diafragma numerică este un parametru important al obiectivului și al lentilei condensatorului și este strâns legată de alți parametri optici ai microscopului. În general, se speră că cu cât este mai mare, cu atât mai bine. Din formulă se poate observa că există două moduri de a mări deschiderea numerică, una este de a crește unghiul gurii oglinzii, iar cealaltă este de a crește indicele de refracție între obiectivul și specimen.
Când se adoptă prima metodă, specimenul și obiectul pot fi ținute cât mai aproape posibil. Dar oricât de aproape, este întotdeauna mai puțin de 180 grade . Astfel, sin( /2) este de asemenea mai mic decât 1. Indicele de refracție al aerului este n=1. Prin urmare, deschiderea numerică nsin(/2) a obiectivului uscat este întotdeauna mai mică decât 1, în general între 0,04 și 0,95.
Atunci când se adoptă această din urmă metodă, se poate adăuga un mediu cu un indice de refracție mai mare între lentila obiectiv și specimen. De exemplu, indicele de refracție al uleiului de cedru este n=1,515. Când uleiul de cedru este utilizat ca mediu, deschiderea numerică poate atinge mai mult de 1,2. De aceea, în unele cazuri se folosesc ochelari cu ulei. În prezent, deschiderea numerică maximă pe care o poate atinge lentila de ulei este de 1,4.
(2) Rezoluție
Rezoluția se mai numește și rată de discriminare sau putere de rezoluție. Așa-numita rezoluție se referă la capacitatea microscopului de a distinge structura fină a obiectului inspectat. Este invers proporțională cu distanța de rezoluție. Distanța de rezoluție se referă la distanța minimă dintre două puncte obiect care pot fi distinse. Cu cât distanța de rezoluție este mai mică, cu atât rezoluția microscopului este mai mare. Dacă distanța dintre două puncte obiect este mai mică decât distanța de rezoluție, cele două puncte vor fi confundate cu un punct, iar structura acestuia nu poate fi văzută clar. Rezoluția microscopului este determinată de obiectivul. Ocularele doar măresc și nu măresc rezoluția microscopului.
În cazul iluminării centrale normale, distanța de rezoluție d a lentilei obiectiv este determinată de următoarea formulă.
d=(λ/2)N.A.
În formula: d reprezintă distanța de rezoluție, unitatea este microni, λ reprezintă lungimea de undă a luminii de iluminare, unitatea este de asemenea microni.
În lumina vizibilă, lungimea de undă cu cea mai mare luminozitate și cea mai mare sensibilitate la ochiul uman este de {{0}},55 μm, iar NA maximă a lentilei obiectiv este de 1,4. Înlocuind în formula de mai sus, d este aproximativ 0.2 μm. Adică, la un microscop optic obișnuit, limita distanței de rezoluție este de 0.2 μm în cazul iluminării centrale. Adică, microscoapele optice obișnuite nu pot face distincția între două obiecte mai mici de 0,2 μm.
Folosind lumina ultravioletă, lungimea de undă a luminii de iluminare poate fi redusă, permițând ca distanța de rezoluție să atingă 0,1 μm. Dar razele ultraviolete nu pot fi văzute de ochiul uman. Poate fi observat doar după ce ați făcut o poză.
Lungimea de undă a fluxului de electroni este de numai 0,00387nm. Folosind „lentila electronică” sau lentila magnetică pentru a controla fluxul de electroni, distanța de rezoluție a microscopului electronic este de până la câteva zecimi de nanometru. Poate fi folosit pentru a observa structura atomilor.
(3) Mărire
Mărirea microscopului este egală cu produsul dintre mărirea lentilei obiectiv și mărirea ocularului. În principiu, mărirea poate fi făcută foarte mare. Cu toate acestea, dacă detaliile specimenului nu pot fi rezolvate de obiectivul, indiferent cât de mare ar fi mărirea, este lipsită de sens. Teoretic, se poate deduce că cea mai potrivită mărire a microscopului (numită mărire efectivă, reprezentată efectiv de M) este între 500 și 1000 de ori deschiderea numerică a obiectivului. Adică 500N.A. Mai mic sau egal cu M efectiv Mai mic sau egal cu 1000N.A.
În intervalul efectiv de mărire, ochii pot observa mult timp fără oboseală. Dacă mărirea este mai mică de 500 NA, va fi dificil de observat. Dacă este mai mare de 1000 N.A., se va deteriora calitatea imaginii și chiar va provoca o imagine ireala. Prin urmare, mărirea peste 1000N.A. se numește mărire nevalidă.
(4) Distanța de lucru
Distanța de lucru se referă la distanța dintre suprafața inferioară a lentilei obiectiv și suprafața superioară a sticlei de acoperire după focalizarea microscopului, folosind o sticlă de acoperire standard și o lungime standard a tubului mecanic. Cu cât mărirea obiectivului este mai mare, cu atât distanța de lucru este mai mică. În general, distanța de lucru a lentilei obiectiv de putere redusă de sub 10 ori este de 5-7mm, în timp ce distanța de lucru a lentilei de ulei de 100 de ori este de numai aproximativ 0,19 mm.
(5) Adâncimea focalizării
Când microscopul este focalizat pe un anumit plan din specimen, nu numai planul obiect poate fi văzut clar, ci și planurile obiectului superior și inferior conectate la acesta pot fi văzute clar în același timp. Distanța dintre planurile obiectului superior și inferior se numește adâncimea de focalizare sau, pe scurt, adâncimea de focalizare.
Adâncimea de focalizare a microscopului este foarte mică și cu cât deschiderea numerică este mai mare, cu atât mărirea totală este mai mare și adâncimea de focalizare mai mică. De exemplu, când utilizați o lentilă de ulei cu un NA de 1,25/100 ori și un ocular de 12,5 ori pentru a observa, adâncimea focalizării este de numai 0,27 μm. Adică, după focalizare, doar un strat subțire de 0,27 μm grosime poate fi văzut clar la un moment dat. Specimenele obișnuite au, în general, grosimea de câțiva microni. Pentru a vedea întregul specimen, este necesar să folosiți mecanismul de reglare fină al microscopului pentru a observa în straturi de sus în jos.
(6) câmp de vedere
Câmpul vizual se mai numește și câmpul vizual. Se referă la scopul obiectului inspectat pe care microscopul îl poate vedea la un moment dat. De obicei ne dorim ca câmpul vizual să fie cât mai mare posibil. Câmpul vizual al microscopului este determinat de câmpul de vedere al lentilei obiectiv și de câmpul de vedere al ocularului. Câmpul vizual al obiectivului obișnuit este mai mic de 20 mm, iar cel mare poate ajunge la mai mult de 40 mm. Câmpul vizual al ocularelor obișnuite de 10x este de 14 mm, iar cele mari pot ajunge la mai mult de 24 mm. Odată proiectate obiectivul și ocularul, câmpul lor vizual este fixat. Deoarece câmpul vizual al unui microscop general este mic, este imposibil să vezi întregul specimen într-un singur câmp vizual, doar un cerc foarte mic pe specimen poate fi văzut. Mai mult, dimensiunea câmpului vizual este invers proporțională cu mărirea totală a microscopului. Cu cât mărirea totală este mai mare, cu atât câmpul vizual este mai mic. Soluția este să folosiți dispozitivul de mișcare pentru a face fiecare parte a specimenului să intre în câmpul vizual pe rând și să observe pe rând.
(7) Luminozitatea oglinzii
Luminozitatea oglinzii se referă la luminozitatea și întunericul imaginii obiectului văzute la microscop. Pentru a facilita observarea, sperăm ca imaginea rezultată să fie mai luminoasă. În cazul luminii externe constante, luminozitatea oglinzii este proporțională cu pătratul deschiderii numerice și invers proporțională cu pătratul măririi totale. Pentru a face imaginea mai luminoasă, ar trebui să se folosească un obiectiv cu o deschidere numerică mare cu un ocular cu mărire redusă. De exemplu, în cazul aceluiași obiectiv, utilizarea unui ocular de 5X va produce o imagine în oglindă de 4 ori mai luminoasă decât utilizarea unui ocular de 10X.
Pentru microscoapele care utilizează surse de lumină electrică, luminozitatea imaginii în oglindă poate fi controlată prin ajustarea luminozității iluminatorului.
(8) Claritate
Claritatea imaginii la microscop depinde de sistemul său optic, în special de performanța optică a lentilei obiectiv. Este legat de proiectarea, fabricarea, utilizarea și depozitarea microscoapelor. Este o problemă importantă și complexă. Din perspectiva utilizării și depozitării, principalele motive care afectează claritatea sunt: grosimea geamului de acoperire folosit este necalificată, focalizarea nu este ajustată la poziția ideală, mărirea totală este prea mare, iar lentila uleiului. lentila nu este ștearsă. Curățați, mucegaiul lentilelor etc.
