Design de microscop cu fluorescență și câmp luminos cu cost redus
În acest ghid, voi trece în revistă principiile de bază ale microscopiei cu fluorescență și cum să construiesc trei microscoape cu fluorescență diferite, cu costuri reduse. Aceste sisteme costă de obicei mii de dolari, dar eforturile recente le-au făcut mai ușor de obținut. Designul pe care îl prezint aici folosește smartphone-uri, dSLR și microscoape USB. Toate aceste modele pot fi utilizate și ca microscoape în câmp deschis.
Pasul 1: Prezentare generală a microscopiei cu fluorescență
Pentru a înțelege conceptele de bază ale microscopiei cu fluorescență, imaginați-vă pădurile dense, copacii, animalele, arbuștii și alte păduri care trăiesc în pădure noaptea. Dacă străluciți o lanternă în pădure, veți vedea toate aceste structuri și este dificil să vă imaginați anumite animale sau plante. Presupunând că ești interesat doar să vezi arbuști de afine în pădure. Pentru a realiza acest lucru, trebuie să antrenezi licuricii să fie atrași doar de tufele de afine, astfel încât atunci când te uiți la pădure, doar tufele de afine să se aprindă. Puteți spune că ați marcat tufele de afine cu licurici, astfel încât să puteți vedea structurile de afine din pădure.
În această analogie, pădurea reprezintă întreaga probă, arbustul de afin reprezintă structura pe care doriți să o vizualizați (cum ar fi celulele specifice sau organitele subcelulare), iar licuricii sunt compuși fluorescenți. Situația de a trage singur cu o lanternă fără licurici este similară cu un microscop cu câmp luminos.
Următorul pas este înțelegerea funcțiilor de bază ale compușilor fluorescenți (cunoscuți și sub denumirea de fluorofori). Grupurile fluorescente sunt de fapt obiecte mici (la scară nanometrică) concepute pentru a conecta structuri specifice din eșantion. Ele absorb lumina dintr-un interval restrâns de lungimi de undă și reemit lumină de altă lungime de undă. De exemplu, un grup fluorescent poate absorbi lumina albastră (adică grupul fluorescent este excitat de lumina albastră) și apoi emite din nou lumină verde. De obicei, acest lucru este rezumat prin spectre de excitație și emisie (așa cum se arată în figura de mai sus). Aceste diagrame arată lungimile de undă ale luminii absorbite de fluorofor și lungimile de undă ale luminii emise de fluorofor.
Designul microscopului este foarte asemănător cu cel al unui microscop obișnuit în câmp deschis, cu două diferențe principale. În primul rând, lumina care iluminează proba trebuie să fie la lungimea de undă a grupului fluorescent excitat (pentru exemplul de mai sus, lumina este albastră). În al doilea rând, microscopul trebuie doar să colecteze lumina emisă (lumină verde) în timp ce blochează lumina albastră. Acest lucru se datorează faptului că lumina albastră este peste tot, dar lumina verde vine doar de la structuri specifice din eșantion. Pentru a bloca lumina albastră, microscoapele au de obicei ceva numit un filtru de trecere lungă care permite luminii verzi să treacă fără lumină albastră. Fiecare filtru trece lung are o lungime de undă de tăiere. Dacă lungimea de undă a luminii este mai mare decât lungimea de undă de tăiere, aceasta poate trece printr-un filtru. Prin urmare, numele este „Long Distance Pass”. Lungimile de undă mai scurte sunt blocate.
Pasul 2: Modelarea unui microscop folosind optica optică
Acesta este un pas suplimentar în proiectarea principiului de bază al unui microscop. Nu este nevoie să construiți un microscop cu fluorescență, așa că dacă nu doriți să vă aprofundați în optică, îl puteți sări peste el.
Atât microscoapele cu câmp luminos, cât și cele cu fluorescență pot fi modelate folosind dispozitive optice cu raze. Premisa de bază a opticii cu raze este că comportamentul luminii este similar cu cel al luminii care se propagă departe de o sursă de lumină. Când te uiți prin cameră, vei vedea lumina soarelui în afara ferestrei sau lumina adusă de becul. Apoi lumina este absorbită sau reflectată de obiectele din cameră. O lumină reflectată o va face să se confrunte cu ochii tăi. Dacă un obiect este iluminat, vă puteți imagina fiecare punct de pe obiect care emite lumină în toate direcțiile (așa cum se arată în imaginea de mai sus). Lentila, la fel ca lentila din ochii noștri, focalizează lumina într-un punct astfel încât să putem vedea obiectul. Fără lentilă, lumina continuă să se propage în exterior și nu formează o imagine.
