Caracteristici și aplicații ale microscopului confocal laser
În timp ce într-un microscop normal planul de imagine al observației este izolat de planurile axiale învecinate prin suprapunerea planului focal al lentilei obiectiv cu detectorul, într-un microscop confocal această izolare se realizează prin iluminarea probei cu un punct limitat de difracție de lumina și filtrarea luminii parazite prin utilizarea unui orificiu în calea luminii colectate la focarul conjugat al acestui punct de lumină pentru a obține această izolare și, astfel, a îmbunătăți rezoluția.
Doar lumina reflectată înapoi de la stratul de probă conjugat poate trece prin orificiul din calea luminii de colectare, în timp ce restul reflexiilor irelevante ale stratului de eșantion sunt blocate de orificiu. Acest lucru oferă o creștere semnificativă a rezoluției. Mai jos este prezentată o comparație alăturată între microscopia cu fluorescență multidimensională și microscopia confocală a aceleiași probe groase. Atunci când o serie de imagini sunt luate la diferite planuri focale, este produsă o imagine denumită în mod obișnuit „z-stack”, care arată câștigurile de rezoluție și contrast furnizate de microscopia confocală și motivele care stau la baza acestor câștiguri. Se poate observa că examinarea imaginii din partea de sus a stivei unde planul de imagistică este deasupra țesutului dezvăluie o cantitate mare de lumină împrăștiată în imaginea cu fluorescență, în timp ce imaginea microscopului confocal pare neagră. Această reducere a PSF în direcția axială contribuie direct la diferența de rezoluție observată la interfața optică din mijlocul stivei z.
Imagini de scanare optică a feliei
O altă caracteristică a microscopiei confocale cu scanare cu laser este că este o tehnică de scanare a imaginii. Tehnicile tradiționale de iluminare cu câmp larg iluminează întreaga probă, astfel încât imaginea să poată fi captată direct cu ochiul liber sau cu un detector, dar LSCM utilizează unul sau mai multe fascicule de lumină focalizate pentru a scana prin eșantion, astfel încât imaginea rezultată este numită felie optică, așa cum se arată în diagrama următoare. Diferența dintre iluminarea tradițională cu câmp larg și iluminarea confocală cu scanare laser este prezentată mai jos.
Prin urmare, o modalitate practică de microscopie confocală modernă este prezentată în figura de mai jos. Lumina de excitație de la laser este trecută printr-o oglindă dicroică și scanată printr-o pereche de oglinzi galvanometre în direcția x și direcția y a probei, iar excitația (sau reflexia) probei trece printr-un orificiu în PMT. detector care urmează să fie înregistrat, iar imaginea scanată înregistrată este reconstruită de un computer pentru a produce o imagine reală a probei.
