Cum se observă morfologia celulelor microbiene la microscop?
Microscoapele au fost inventate pentru a vedea obiecte zâmbitoare care nu pot fi văzute cu ochiul liber. Microorganismele sunt foarte mici, așa că trebuie mărite și observate cu ajutorul unui microscop. În plus, există multe tipuri de microorganisme, așa că practic majoritatea microscoapelor optice pot observa microorganisme. Următoarea întrebare este ce tip de microscop ar trebui utilizat pentru observarea și analiza ce fel de microorganisme. Microscoapele obișnuite care pot fi utilizate pentru a observa morfologia microbiană includ microscoape biologice, microscoape cu contrast de fază, microscoape inversate, microscoape cu fluorescență, microscoape confocale etc.
Mai jos sunt descrise diferitele microscoape utilizate pentru observarea microorganismelor:
1. Microscopul optic obișnuit folosește lumină naturală sau lumină ca sursă de lumină, iar lungimea sa de undă este de aproximativ 0.4 μm. Rezoluția microscopului este de jumătate din lungimea de undă, adică 0,2 μm, iar cea mai mică imagine vizibilă cu ochiul liber este de 0,2 mm. Prin urmare, utilizarea unei oglinzi de ulei (imersie) pentru a mări de 1000 ori poate mări particulele de 0,2 μm în 0,2 mm vizibile cu ochiul liber. Microscoapele optice obișnuite pot fi utilizate pentru observarea bacteriilor, actinomicetelor și ciupercilor.
2. Microscopia câmpului întunecat este folosită în mod obișnuit pentru a observa morfologia și mișcarea microbiană necolorate. După ce condensatorul de câmp întunecat este instalat în microscopul obișnuit, lumina nu poate pătrunde direct din mijloc, iar câmpul vizual este întunecat. Când specimenul primește lumină oblică de la marginea condensatorului, acesta poate fi împrăștiat, astfel încât microorganismele strălucitoare precum bacteriile sau spirochetele pot fi observate pe fundalul câmpului întunecat.
3. Microscop cu contrast de fază Microscopul cu contrast de fază utilizează efectul de lumină al plăcii de diferență de fază pentru a schimba faza luminii și amplitudinea luminii directe și pentru a converti diferența de fază a luminii în diferență de intensitate a luminii. Sub un microscop cu contrast de fază, atunci când lumina trece printr-un specimen necolorat, diferența de fază luminoasă este cauzată de inconsecvența densității diferitelor părți ale specimenului și pot fi observate morfologia, structura internă și modul de mișcare a microorganismelor.
4. Microscop cu fluorescență Microscopul cu fluorescență este practic același cu microscopul optic obișnuit, principala diferență este sursa de lumină, filtrul și condensatorul. În prezent, majoritatea folosesc dispozitive epi-light, iar lămpile cu mercur de înaltă presiune sunt utilizate în mod obișnuit ca surse de lumină, care pot emite lumină ultravioletă sau albastru-violetă. Există două tipuri de filtre: filtru de excitație și filtru de absorbție. Pe lângă condensatoarele generale cu câmp luminos, condensatoarele cu câmp întunecat pot fi utilizate și în microscoapele cu fluorescență care utilizează lumină albastră pentru a îmbunătăți contrastul dintre fluorescență și fundal. Această metodă este aplicabilă pentru detectarea sau identificarea bacteriilor colorate cu pigmenți fluorescenți sau combinate cu anticorpi fluorescenți.
5. Microscoapele electronice folosesc fluxul de electroni ca sursă de lumină, iar lungimea de undă este de zeci de mii de ori diferită de lumina vizibilă, ceea ce îmbunătățește foarte mult rezoluția. De asemenea, folosește o bobină magnetică ca sistem de amplificare optică, iar mărirea poate ajunge la zeci de mii sau sute de mii de ori. Este adesea folosit pentru observarea particulelor de virus și a ultrastructurii bacteriene.
Observarea probelor microbiene necolorate:
Specimenele necolorate pot fi utilizate în general pentru a observa morfologia bacteriilor, puterea și mișcarea. Bacteriile sunt incolore și transparente atunci când nu sunt colorate și sunt observate la microscop în principal prin diferența dintre indicele de refracție al bacteriilor și mediul înconjurător. Bacteriile cu flageli se mișcă viguros, în timp ce bacteriile fără flageli prezintă mișcare browniană neregulată. Bacteriile viabile precum Treponema pallidum, Leptospira și Campylobacter au forme și modele de mișcare distincte, care au o semnificație diagnostică. Metodele utilizate în mod obișnuit sunt metoda căderii presiunii, metoda căderii suspendate și metoda capilară.
1. Aplicați vaselină în jurul orificiului concav al sticlei concave curate prin metoda picăturii suspendate, utilizați o buclă de inoculare pentru a lua un inel de suspensie bacteriană și așezați-l în centrul sticlei de acoperire, apoi aliniați orificiul concav al sticlei concave cu picătură în centrul sticlei de acoperire și acoperiți-l, apoi întoarceți-l repede, apăsați ușor capacul pentru a face să se lipească strâns de vaselina de pe marginea găurii concave și observați la microscop cu mărire mare (sau câmp întunecat).
2. Luați un inel de suspensie bacteriană cu o buclă de inoculare și plasați-l în centrul unei lame de sticlă curată prin metoda căderii de presiune și acoperiți ușor suspensia bacteriană cu un pahar de acoperire, având grijă să evitați bulele și revărsarea suspensiei bacteriene. . După ce ați stat nemișcat pentru câteva secunde, observați la un microscop de mare putere în câmp luminos (sau câmp întunecat).
3. Metoda capilară este utilizată în principal pentru examinarea cineticii bacteriilor anaerobe. De obicei alegeți 60~70mm lungime. După sifonarea suspensiei de bacterii anaerobe printr-un capilar cu o deschidere de 0,5-1,0 mm, etanșați cele două capete ale capilarului cu o flacără. Capilarul a fost fixat pe lama de sticlă cu hârtie de plastic și observat sub o lentilă de mare putere în câmp întunecat.
Observarea specimenelor microbiene colorate cu un microscop:
După ce specimenul bacterian este colorat, datorită contrastului puternic de culoare dintre bacterii și mediul înconjurător, caracteristicile morfologice ale bacteriilor (cum ar fi dimensiunea, forma, aranjarea etc.) ale bacteriilor și unele structuri speciale (cum ar fi sub formă de capsule, flageli, spori etc.) pot fi observate clar la un microscop optic obișnuit, iar bacteriile pot fi clasificate și identificate în funcție de reactivitatea colorării.
(1) Procedura generală de colorare bacteriană Procedura generală de colorare bacteriană este: frotiu (uscare)—fixare—colorare.
1. Frotiuri Pregătirea sângelui, secrețiilor, excrețiilor, fluidelor de puncție și culturilor lichide și frotiuri directe de peliculă subțire pe lamele de sticlă; autopsie sau țesuturi animale infectate, ungeți leziunea cu un tampon de bumbac pentru prelevare. Pentru prepararea coloniilor bacteriene sau a gazonului pe mediu solid, utilizați mai întâi o ansă de inoculare pentru a lua un inel de soluție salină normală și puneți-l în centrul lamei de sticlă, apoi utilizați o ansă de inoculare sterilă pentru a lua o cantitate mică de cultură și a măcina se întinde uniform în soluție salină normală, se întinde pe o suprafață acoperită de 1 cm2 și se lasă să se usuce în mod natural la temperatura camerei sau se usucă lent la distanță.
2. Scopul fixării este de a ucide bacteriile, de a coagula proteina și structura bacteriană și de a facilita colorarea; promovează bacteriile să adere la lamă pentru a evita să fie spălate de apă în timpul spălării; schimba permeabilitatea bacteriilor la coloranți, ceea ce este benefic pentru colorarea structurilor intracelulare bacteriene. Se fixează de obicei prin încălzire cu o flacără, iar frotiul uscat este trecut rapid prin flacără de 3 ori. Este mai bine să nu ardeți pielea de pe dosul mâinii când atinge diapozitivul.
3. Vopsirea În funcție de diferitele scopuri de inspecție, alegeți diferite metode de vopsire pentru vopsire. Când vopsiți, adăugați soluția de colorant în picături pentru a crește gradul de acoperire.
4. Mordant Orice substanță care poate spori afinitatea dintre colorant și obiectul vopsit, poate fixa colorantul pe obiectul vopsit și poate provoca o modificare a permeabilității membranei celulare se numește mordant. Utilizate în mod obișnuit sunt alaunul, acidul tanic, sărurile metalice și iodul etc., iar încălzirea este, de asemenea, folosită pentru a promova colorarea. Mordanții pot fi utilizați între colorarea primară și contracolorarea și pot fi utilizați și după fixare sau conținute în fixativ și colorare.
5. Decolorarea Orice agent chimic care poate elimina culoarea obiectului vopsit se numeste decolorant. Etanolul, acetona etc. sunt utilizate în mod obișnuit ca decoloranți. Agentul de decolorare poate detecta gradul de stabilitate al combinației de bacterii și coloranți, care poate fi utilizat pentru colorarea diferențială.
6. Contracolorarea Bacteriile sau structurile lor care au fost decolorate sunt adesea contracolorate cu o soluție de contracolorare pentru o observare ușoară. Culoarea soluției de contracolorare este diferită de cea a soluției primare de vopsire pentru a forma un contrast puternic. Contracolorarea nu trebuie să fie prea puternică, pentru a nu acoperi culoarea colorării inițiale.
