Cum diferă microscopia cu fluorescență de microscopia convențională
Recent am încercat să fac câteva secțiuni congelate de șoareci, iar acum trebuie să folosesc un microscop cu fluorescență pentru a vedea dacă virusul pe care l-am injectat se află în zona dorită a creierului. Unele principii de bază ale microscopiei cu fluorescență trebuie studiate pe scurt și le voi împărtăși aici.
Microscopul cu fluorescență folosește lumina ultravioletă ca sursă de lumină pentru a ilumina obiectul testat, determinând obiectul să emită o sursă de lumină și apoi să observe obiectul la microscop. Folosit în principal pentru celulele cu imunofluorescență, este compus dintr-o sursă de lumină, un sistem de plăci de filtrare și un sistem optic pentru a observa imaginea fluorescentă a probei prin mărirea ocularului și a lentilei obiectiv. Să aruncăm o privire la diferența dintre acest microscop cu fluorescență și un microscop optic obișnuit.
1. În ceea ce privește metodele de iluminare
Metoda de iluminare a unui microscop cu fluorescență utilizează, în general, o metodă cu fascicul descendent, ceea ce înseamnă că sursa de lumină este proiectată pe proba de testare prin lentila obiectivului.
2. În ceea ce privește rezoluția
Microscopia cu fluorescență folosește ca sursă de lumină lumina ultravioletă, cu o lungime de undă relativ scurtă, dar cu o rezoluție mai mare decât microscoapele optice obișnuite.
3. Diferențele la filtru
Un microscop cu fluorescență folosește două filtre speciale, unul în fața sursei de lumină pentru a filtra lumina vizibilă, iar celălalt între obiectiv și ocular pentru a filtra lumina ultravioletă, care poate proteja ochii.
Microscopia cu fluorescență este, de asemenea, un tip de microscop optic, în principal pentru că lungimea de undă excitată de microscopia cu fluorescență este scurtă, ceea ce duce la diferențe în structura și utilizarea microscopiei cu fluorescență și a microscopiei obișnuite. Majoritatea microscoapelor cu fluorescență au o funcție bună de captare a luminii slabe, astfel încât capacitatea lor de imagistică este bună și sub fluorescență extrem de slabă. În plus, odată cu îmbunătățirea continuă a microscopiei cu fluorescență din ultimii ani, zgomotul a fost, de asemenea, redus semnificativ. Prin urmare, se aplică tot mai multe microscoape cu fluorescență.
Cunoștințe legate de microscopia cu fluorescență cu doi fotoni
Principiul de bază al excitației cu doi fotoni este că la o densitate mare de fotoni, moleculele fluorescente pot absorbi simultan doi fotoni cu lungime de undă lungă și, după o perioadă scurtă de așa-numita viață în stare excitată, emite un foton cu lungime de undă mai scurtă; Efectul său este același cu utilizarea unui foton cu o lungime de undă de jumătate din lungimea de undă lungă pentru a excita molecule fluorescente. Excitarea cu doi fotoni necesită o densitate mare de fotoni și, pentru a evita deteriorarea celulelor, un laser cu impulsuri blocate în mod de energie înaltă este utilizat într-un microscop cu doi fotoni. Laserul emis de acest tip de laser are energie de vârf ridicată și energie medie scăzută, cu o lățime a impulsului de doar 100 de femtosecunde și o frecvență de până la 80 până la 100 megaherți. Când se utilizează un obiectiv cu deschidere numerică mare pentru a focaliza fotonii unui laser pulsat, densitatea fotonului la punctul focal al obiectivului este cea mai mare, iar excitația cu doi fotoni are loc numai la punctul focal al obiectivului. Prin urmare, un microscop cu doi fotoni nu necesită găuri confocale, ceea ce îmbunătățește eficiența detectării fluorescenței.
În fenomenele generale de fluorescență, din cauza densității scăzute de fotoni a excitației, o moleculă fluorescentă poate absorbi doar un foton în același timp și apoi emite un foton fluorescent prin tranziție la radiație, care se numește fluorescență cu un singur foton. Pentru procesul de excitare a fluorescenței folosind laserul ca sursă de lumină, pot apărea fenomene de fluorescență cu doi fotoni sau chiar multifotoni. În acest moment, sursa de lumină de excitație utilizată este de mare intensitate, iar densitatea fotonului îndeplinește cerința ca moleculele fluorescente să absoarbă doi fotoni simultan. În procesul de utilizare a unui laser tipic ca sursă de lumină de excitație, densitatea fotonului încă nu este suficientă pentru a genera fenomenul de absorbție a doi fotoni. În mod obișnuit, se folosesc lasere cu impulsuri de femtosecundă, iar puterea lor instantanee poate atinge nivelul de megawați. Prin urmare, lungimea de undă a fluorescenței cu doi fotoni este mai scurtă decât cea a excitației, ceea ce este echivalent cu efectul produs de excitația la jumătatea lungimii de undă de excitare.
