Caracteristici și aplicații ale microscopiei laser confocale
Microscopul confocal cu scanare laser (LSCM) este un tip de microscop proiectat pe baza tehnologiei de focalizare conjugată, adică pentru a face sursa de lumină laser, proba supusă testului și detectorul, toate în poziția conjugată unul altuia.
Fundamental
În microscoapele generale, planul focal al lentilei obiectiv coincide cu detectorul, astfel încât planul imaginii observate este izolat de planul axial adiacent, în timp ce la microscoapele confocale, proba este iluminată utilizând un punct de lumină cu difracție limitată, iar în Acest efect de izolare este obținut prin utilizarea unui orificiu în calea luminii de colectare la punctul focal al conjugatului spot pentru a filtra lumina parazită pentru a îmbunătăți rezoluția.
Caracteristici de imagistică
Doar lumina reflectată înapoi din stratul de probă conjugat poate trece prin orificiul mic din calea luminii de colectare, iar reflexiile rămase irelevante ale stratului de probă sunt blocate de orificiul mic. Acest lucru poate duce la o creștere semnificativă a rezoluției. Mai jos este prezentată o comparație alăturată între microscopia cu fluorescență multidimensională și microscopia confocală a aceleiași probe groase. Atunci când o serie de imagini sunt luate la diferite planuri focale, ceea ce este denumit în mod obișnuit „z-stack” poate fi generat, iar această imagine arată atât câștigurile de rezoluție, cât și de contrast oferite de microscopia confocală, cât și cauzele care stau la baza acestor câștiguri. Examinarea imaginii din partea de sus a stivei cu planul de imagine deasupra țesutului dezvăluie multă lumină împrăștiată în imaginea cu fluorescență, în timp ce imaginea confocală pare neagră. Această reducere a PSF în direcția axială este direct responsabilă pentru diferența de rezoluție observată la interfața optică din mijlocul stivei z.
O altă caracteristică a microscopiei confocale cu scanare cu laser este că este o tehnologie de scanare a imaginii. Tehnologia tradițională de iluminare cu câmp larg luminează întregul eșantion, astfel încât imaginea poate fi captată direct cu ochiul liber sau cu un detector, dar LSCM folosește un fascicul sau mai multe fascicule focalizate trec prin eșantion pentru scanare și imagine, iar imaginea rezultată este numită secțiune optică. Următoarele arată diferența dintre metoda tradițională de iluminare cu câmp larg și metoda de iluminare confocală cu scanare laser.
Prin urmare, o metodă practică de lucru a unui microscop confocal modern este prezentată în figura de mai jos. Lumina de excitație emisă de laser trece printr-o oglindă dicroică și scanează în direcțiile x și y ale probei printr-o pereche de oglinzi vibrante. Excitația (sau reflexia) eșantionului Lumina intră în detectorul PMT prin gaură și este înregistrată, iar imaginea de scanare înregistrată este reconstruită de computer pentru a obține imaginea eșantionului real.
