Diferențele și caracteristicile dintre microscopul cu fluorescență și microscopul optic obișnuit
Microscopul cu fluorescență este diferit de microscopul optic obișnuit. Nu observă specimenul prin iluminarea unei surse de lumină obișnuite. În schimb, folosește lumină de o anumită lungime de undă (de obicei, lumină ultravioletă, lumină albastră-violetă) pentru a excita materialul fluorescent din specimen la microscop, determinându-l să emită fluorescență. Prin urmare, sursa de lumină a unui microscop cu fluorescență nu servește ca iluminare directă, ci ca o sursă de energie care excită materialul fluorescent intern al specimenului. Motivul pentru care putem observa specimenul nu se datorează iluminării sursei de lumină, ci fenomenului de fluorescență cauzat de materialul fluorescent din specimen care absoarbe energia luminoasă excitată. Se poate observa că principala caracteristică a unui microscop cu fluorescență este că sursa sa de lumină poate furniza o cantitate mare de lumină de excitație într-un interval specific de lungimi de undă, astfel încât substanțele fluorescente din specimenul examinat să poată obține intensitatea necesară a luminii de excitație. În același timp, microscoapele cu fluorescență trebuie să aibă sisteme de filtrare corespunzătoare. Microscopia cu fluorescență este un instrument esențial pentru histochimia avansată a fluorescenței. Este compus dintr-o sursă de lumină de ultra-înaltă presiune, sistem de filtrare (inclusiv plăci de filtrare de excitație și suprimare), sistem optic și sistem de fotografie. Utilizează lumină de o anumită lungime de undă pentru a excita specimenul să emită fluorescență.
1. Modalități de a excita fluorescența: În funcție de intervalul de lungimi de undă a luminii, aceasta este împărțită în două tipuri: metoda de excitare UV (folosind metoda de iluminare ultravioletă) și metoda de excitare BV (folosind lumină albastru-violetă). Metoda de excitare UV folosește lumină aproape ultravioletă mai scurtă de 400 nm pentru excitare. Nu există lumină de excitație vizibilă în această metodă, astfel încât fluorescența observată arată fluorescența inerentă a colorantului, ceea ce face ușor să distingem fluorescența specifică pe specimen de autofluorescența țesutului de fundal.
2. Metoda de excitare BV: excitație de la ultravioletă la lumină albastră centrată la 404nm și 434nm. Această metodă folosește lumină albastră pentru a ilumina specimenul, astfel încât filtrul de tăiere al sistemului de observare a fluorescenței trebuie să folosească un filtru care poate bloca complet lumina albastră și poate trece complet fluorescența verde și galbenă necesară. Coloranți fluorescenți utilizați în metodele cu anticorpi fluorescenți. Lungimea de undă maximă de absorbție a luminii de excitație și lungimea de undă maximă de emisie a fluorescenței sunt relativ apropiate, astfel încât filtrul utilizat în metoda de excitare BV trebuie să folosească un filtru de tăiere ascuțit. Această metodă poate folosi lumina albastră ca lumină de excitație, astfel încât eficiența de absorbție a pigmenților fluorescenți este mai mare și se pot obține imagini mai luminoase. Dezavantajul este că fluorescența sub 500nm nu poate fi văzută, în timp ce fluorescența peste 500nm face ca întreaga imagine să pară galbenă. În metoda anticorpilor fluorescenți, specificitatea colorantului fluorescent este în mare parte apreciată după culoarea sa unică. Prin urmare, atunci când discutăm despre specificitatea subtilă, deficiențele menționate mai sus ale metodei de excitare BV au adesea un impact mare.
