Diferența dintre microscopul cu fluorescență și microscopul normal
1. Uită-te la metoda de iluminare
Metoda de iluminare a microscopului cu fluorescență este în general de tip epi, adică sursa de lumină este plasată pe proba de testare prin lentila obiectivului.
2. Uită-te la rezoluție
Microscoapele cu fluorescență folosesc ca sursă de lumină lumina ultravioletă, cu o lungime de undă relativ scurtă, dar rezoluția este mai mare decât cea a microscoapelor optice obișnuite.
3, diferența de filtru
Microscopul cu fluorescență folosește două filtre speciale, folosite în fața sursei de lumină pentru a filtra lumina vizibilă și utilizate între obiectiv și ocular pentru a filtra lumina ultravioletă, care poate proteja ochii omului.
Microscopul cu fluorescență este, de asemenea, un tip de microscop optic, în principal pentru că lungimea de undă excitată de microscopul cu fluorescență este scurtă, astfel încât aceasta duce la diferența în structura și utilizarea microscopului cu fluorescență și a microscopului obișnuit. Majoritatea microscoapelor cu fluorescență au o funcție bună de a capta lumina slabă. , deci sub fluorescență extrem de slabă, capacitatea sa de imagistică este de asemenea bună. Împreună cu îmbunătățirea continuă a microscopiei cu fluorescență din ultimii ani, zgomotul a fost, de asemenea, mult redus. Prin urmare, se folosesc tot mai multe microscoape cu fluorescență.
Cunoașterea microscopiei cu fluorescență cu doi fotoni
Principiul de bază al excitației cu doi fotoni este: în cazul unei densități mari de fotoni, moleculele fluorescente pot absorbi doi fotoni cu lungime de undă lungă în același timp, iar după o durată de viață așa-numită stare excitată foarte scurtă, emite un foton cu lungime de undă scurtă. ; efectul este același cu utilizarea unui foton cu o lungime de undă jumătate din lungimea de undă lungă pentru a excita o moleculă fluorescentă. Excitarea cu doi fotoni necesită o densitate mare de fotoni și, pentru a nu deteriora celulele, microscopia cu doi fotoni utilizează lasere pulsate blocate în mod de înaltă energie. Acest laser emite lumină laser cu energie de vârf ridicată și energie medie scăzută, cu o lățime a impulsului de numai 100 femtosecunde și o frecvență de 80 până la 100 MHz. Când se folosește o lentilă obiectiv cu deschidere numerică mare pentru a focaliza fotonii laserului pulsat, densitatea fotonului la punctul focal al lentilei obiectiv este cea mai mare, iar excitația cu doi fotoni are loc numai la punctul focal al lentilei obiectiv, astfel încât microscopul cu doi fotoni nu are nevoie de un orificiu confocal, ceea ce îmbunătățește eficiența detectării fluorescenței.
În fenomenul general de fluorescență, datorită densității scăzute de fotoni a luminii de excitație, o moleculă fluorescentă poate absorbi doar un foton în același timp și apoi emite un foton fluorescent prin tranziția la radiație, care se numește fluorescență cu un singur foton. Pentru procesul de excitare a fluorescenței cu laser ca sursă de lumină, poate apărea un fenomen de fluorescență cu doi fotoni sau chiar multi-fotoni. În acest moment, intensitatea sursei de lumină de excitație utilizată este mare, iar densitatea fotonului îndeplinește cerința ca molecula fluorescentă să absoarbă doi fotoni în același timp. În procesul de utilizare a unui laser general ca sursă de lumină de excitație, densitatea fotonului nu este încă suficientă pentru a produce absorbția de doi fotoni. De obicei, se folosește un laser cu impulsuri femtosecunde, iar puterea sa instantanee poate ajunge de ordinul megawaților. Prin urmare, lungimea de undă a fluorescenței cu doi fotoni este mai mică decât lungimea de undă a luminii de excitație, ceea ce este echivalent cu efectul produs de excitația cu lungimea de undă de jumătate de excitare.
Microscopia cu fluorescență cu doi fotoni are multe avantaje:
1) Lumina cu lungime de undă lungă este mai puțin afectată de împrăștiere decât lumina cu lungime de undă scurtă și poate pătrunde cu ușurință în specimen;
2) Moleculele fluorescente din afara planului focal nu sunt excitate, astfel încât mai multă lumină de excitație poate ajunge în planul focal, astfel încât lumina de excitație poate pătrunde în specimene mai adânci;
3) Lumina aproape infraroșie cu lungime de undă lungă este mai puțin toxică pentru celule decât lumina cu lungime de undă scurtă;
4) La vizualizarea specimenelor cu microscopie cu doi fotoni, fotoalbirea și fototoxicitatea sunt prezente numai în planul focal. Prin urmare, microscopia cu doi fotoni este mai potrivită pentru vizualizarea specimenelor groase decât microscopia cu un singur foton, pentru vizualizarea celulelor vii sau pentru efectuarea experimentelor de fotoalbire cu punct fix.
Cunoașterea microscopiei cu fluorescență confocală
Principiul de bază al microscopiei cu fluorescență confocală: folosind o sursă de lumină punctuală pentru a ilumina specimenul, se formează un mic punct de lumină cu un contur bine definit pe planul focal. constituit din separatorul de fascicule. Divizorul de fascicul trimite fluorescența direct la detector. În fața sursei de lumină și a detectorului există un orificiu, numit orificiu de iluminare și orificiu de detectare. Dimensiunile geometrice ale celor două sunt aceleași, aproximativ 100-200 nm; față de punctul de lumină de pe planul focal, cele două sunt conjugate, adică punctul de lumină trece printr-o serie de lentile și, în sfârșit, poate fi focalizat pe orificiul de iluminare și pe orificiul de detectare în același timp. În acest fel, lumina din planul focal poate fi concentrată în intervalul găurii de detectare, în timp ce lumina împrăștiată de deasupra sau de sub planul focal este blocată din orificiul de detectare și nu poate fi fotografiată. Eșantionul este scanat punct cu punct cu laserul, iar tubul fotomultiplicator după detectarea orificiului obține, de asemenea, imaginea confocală a punctului cu punct de lumină corespunzătoare, care este convertită într-un semnal digital și transmisă computerului și, în final, agregată pe ecranul într-o imagine confocală clară a întregului plan focal. .
Fiecare imagine din plan focal este de fapt o secțiune transversală optică a specimenului, iar această secțiune transversală optică are întotdeauna o anumită grosime, cunoscută și sub numele de felie optică. Deoarece intensitatea luminii la punctul focal este mult mai mare decât cea a punctului non-focal, iar lumina planului non-focal este filtrată de orificiu, adâncimea de câmp a sistemului confocal este aproximativ zero, iar scanarea de-a lungul Axa Z poate realiza tomografie optică, formând o secțiune optică bidimensională la punctul focalizat al probei. Combinând scanarea planului XY (planul focal) cu scanarea pe axa Z (axa optică), prin acumularea de imagini bidimensionale ale straturilor succesive și prelucrarea prin software special de calculator, se poate obține o imagine tridimensională a probei.
Adică, orificiul de detectare și orificiul sursei de lumină sunt întotdeauna focalizate în același punct, astfel încât fluorescența excitată în afara planului de focalizare nu poate intra în orificiul de detectare.
Expresia simplă a principiului de lucru al laserului confocal este că folosește un laser ca sursă de lumină și, pe baza imaginilor tradiționale cu microscop cu fluorescență, sunt atașate un dispozitiv de scanare cu laser și un dispozitiv de focalizare conjugat, iar achiziția și procesarea imaginilor digitale. sistemul este controlat de un computer.
