Diferența dintre un microscop cu fluorescență și un microscop normal
Recent am încercat să fac câteva secțiuni congelate de șoareci. În continuare, voi folosi un microscop cu fluorescență pentru a vedea dacă virusul pe care l-am injectat se află în zona creierului pe care o doresc. Unele principii de bază ale microscopiei cu fluorescență trebuie învățate pe scurt și le voi împărtăși aici.
Microscoapele cu fluorescență folosesc lumina ultravioletă ca sursă de lumină pentru a ilumina obiectul inspectat, determinând obiectul să emită lumină și apoi observă obiectul la microscop. Este utilizat în principal pentru celulele de imunofluorescență. Este compus în principal dintr-o sursă de lumină, un sistem cu plăci de filtrare și un sistem optic. Imaginea fluorescentă a probei este observată prin mărirea ocularului și a lentilei obiectivului. Să aruncăm o privire la diferența dintre un microscop cu fluorescență și un microscop optic obișnuit.
1. Uită-te la metoda de iluminare
Metoda de iluminare a microscopului cu fluorescență este, în general, epi-iluminarea, ceea ce înseamnă că sursa de lumină este plasată pe proba de testare prin lentila obiectivului.
2. Uită-te la rezoluție
Microscoapele cu fluorescență folosesc ca sursă de lumină lumina ultravioletă, care are o lungime de undă mai scurtă, dar o rezoluție mai mare decât microscoapele optice obișnuite.
3. Diferențele de filtre
Microscoapele cu fluorescență folosesc două filtre speciale, unul folosit în fața sursei de lumină pentru a filtra lumina vizibilă și unul folosit între lentila obiectiv și ocular pentru a filtra razele ultraviolete, care pot proteja ochii omului.
Microscopul cu fluorescență este, de asemenea, un tip de microscop optic. Motivul principal este că lungimea de undă excitată de microscopul cu fluorescență este scurtă, astfel încât aceasta duce la diferența de structură și utilizare între microscopul cu fluorescență și microscopul obișnuit. Majoritatea microscoapelor cu fluorescență au o funcție bună de a capta lumina slabă. , astfel încât capacitatea sa de imagistică este bună și sub fluorescență extrem de slabă. Împreună cu îmbunătățirea continuă a microscoapelor cu fluorescență din ultimii ani, zgomotul a fost, de asemenea, mult redus. Prin urmare, se folosesc tot mai multe microscoape cu fluorescență.
Cunoștințe despre microscopia cu fluorescență cu doi fotoni
Principiul de bază al excitației cu doi fotoni este: în condițiile unei densități mari de fotoni, moleculele fluorescente pot absorbi doi fotoni cu lungime de undă lungă în același timp și, după o scurtă durată de viață așa-numită stare excitată, emite un foton cu o lungime de undă mai scurtă. . ;Efectul este același cu utilizarea unui foton cu o lungime de undă jumătate din lungimea de undă lungă pentru a excita molecule fluorescente. Excitarea cu doi fotoni necesită o densitate mare de fotoni. Pentru a nu deteriora celulele, microscoapele cu doi fotoni folosesc lasere cu impulsuri blocate în mod de înaltă energie. Acest laser emite lumină laser cu energie de vârf ridicată și energie medie scăzută, cu o lățime a impulsului de numai 100 femtosecunde și o frecvență de 80 până la 100 MHz. Când utilizați un obiectiv cu deschidere numerică mare pentru a focaliza fotonii laserului pulsat, densitatea fotonului la focalizarea obiectivului este cea mai mare. Excitația cu doi fotoni are loc doar la focalizarea lentilei obiectiv, astfel încât microscopul cu doi fotoni nu necesită un orificiu confocal, ceea ce îmbunătățește eficiența detectării fluorescenței.
În fenomenul general de fluorescență, datorită densității scăzute a fotonului luminii de excitație, o moleculă fluorescentă poate absorbi doar un foton în același timp și apoi emite un foton de fluorescență printr-o tranziție radiativă. Aceasta este fluorescența cu un singur foton. Pentru procesul de excitare a fluorescenței folosind laserul ca sursă de lumină, pot apărea fenomene de fluorescență cu doi fotoni sau chiar multi-fotoni. În acest caz, intensitatea sursei de lumină de excitație utilizată este mare, iar densitatea fotonului îndeplinește cerința ca moleculele fluorescente să absoarbă doi fotoni în același timp. În procesul de utilizare a laserelor obișnuite ca surse de lumină de excitație, densitatea fotonului nu este încă suficientă pentru a produce absorbția de doi fotoni. De obicei se folosesc lasere cu impulsuri femtosecunde, iar puterea lor instantanee poate atinge nivelul de megawați. Prin urmare, lungimea de undă a fluorescenței cu doi fotoni este mai mică decât lungimea de undă a luminii de excitație, ceea ce este echivalent cu efectul produs de excitația cu lungimea de undă cu jumătate de excitație.
