Structura de bază a microscopiei confocale cu fluorescență
(1) Modul de scanare
Modulul de scanare constă în principal dintr-o bară luminoasă pinhole (controlând grosimea feliilor optice), un spectroscop (schimbând direcția de propagare a luminii în funcție de lungimea de undă), un colorimetru cu fluorescență de emisie (selectând lumina într-un anumit interval de lungimi de undă pentru detectare) și un detector (tub fotomultiplicator). Fluorescența mixtă din proba fluorescentă intră în scaner și, după ce a fost selectată de bara luminoasă de detectie, spectrometru și colorimetru, este împărțită în diverse fluorescențe monocromatice, care sunt detectate în diferite canale de fluorescență și formează imagini confocale corespunzătoare. În același timp, mai multe imagini paralele cu fluorescență monocromatică și imaginile lor compuse pot fi afișate pe ecranul computerului.
(2) Sistem de microscopie cu fluorescență
Microscopul este componenta principală a LSCM, care este legată de calitatea imaginii a sistemului. Calea optică a microscopului poate fi introdusă cu ușurință într-un sistem optic la infinit depărtat, cu opțiuni optice, fără a afecta calitatea imaginii și acuratețea măsurării. Obiectivul ar trebui să fie un obiectiv apocromatic cu câmp plat cu deschidere numerică mare, care este benefic pentru achiziția fluorescenței și imagini clare. Conversia grupului de lentile obiectiv, selectarea grupului de filtre de culoare, reglarea mișcării scenei și blocarea memoriei planului focal ar trebui să fie controlate automat de computer.
Microscopul cu fluorescență utilizat în microscopia confocală cu scanare cu laser este în general același cu un microscop cu fluorescență convențional, dar are propriile sale caracteristici: trebuie conectat la un scaner, astfel încât laserul să poată intra în obiectivul microscopului pentru a iradia proba și a face fluorescența emisă de probă ajunge la detector; Este necesar un dispozitiv de conversie a traiectoriei luminii, care convertește lămpile cu mercur în lasere, iar intensitatea luminii lămpii cu mercur poate fi ajustată.
(3) Lasere comune
Sursele laser utilizate în microscopia confocală cu scanare cu laser includ sisteme cu laser unic și laser multiplu, iar laserele utilizate în mod obișnuit includ următoarele trei tipuri:
Laser semiconductor: 405 nm (aproape de linia spectrală ultravioletă)
Laser cu ioni argon: 457nm, 477nm, 488nm, 514nm (lumină albastră verde)
Laser He-Ne: 543nm (laser verde He-Ne cu lumină verde) 633nm (laser roșu He-Ne cu lumină roșie)
Laser UV (laser UV): 351 nm, 364 nm (lumină UV)
(4) Echipamente auxiliare
Sisteme de răcire răcite cu aer, răcite cu apă și surse de alimentare reglate.
Principiul de bază de lucru al unui microscop confocal cu scanare laser este să emită mai întâi o anumită lungime de undă a luminii de excitație de la laser. După amplificare, lumina trece prin bara luminoasă iluminată din scaner pentru a forma o sursă de lumină punctiformă. Lentila obiectiv se concentrează pe planul focal al probei, iar punctele iluminate corespunzătoare de pe eșantion sunt excitate și emit fluorescență. După ce trece prin bara luminoasă a orificiului de detectare, ajunge la detector și este fotografiată pe ecranul de monitorizare a computerului. În acest fel, o imagine confocală completă este formată din imaginile de fluorescență ale fiecărui punct al probei de pe planul focal, care se numește o felie de lumină.
