O evaluare a diferitelor metode de microscopie cu super-rezoluție
Pentru microscopia cu lumină convențională, difracția luminii limitează rezoluția imaginii la aproximativ 250 nm. Astăzi, tehnicile de super-rezoluție pot îmbunătăți acest lucru cu mai mult de un factor de 10. Această tehnică este realizată în principal prin trei metode: microscopia de localizare cu o singură moleculă, inclusiv microscopia de localizare fotosensibilă (PALM) și microscopia de reconstrucție optică stocastică (STORM); microscopie cu iluminare structurată (SIM); și microscopie stimulată de epuizare a emisiilor (STED). Cum să alegeți tehnologia super-rezoluție este ceea ce interesează tuturor. „Din păcate, nu există principii simple pentru a decide ce metodă să folosească”, spune Mathew Stracy, cercetător postdoctoral la Universitatea din Oxford, Marea Britanie. „Fiecare are propriile sale avantaje și dezavantaje.” Desigur, oamenii de știință își dau seama și cum să aleagă metoda potrivită pentru un anumit proiect. „În contextul bioimaginii, factorii cheie de luat în considerare includ: rezoluția spațială și temporală, sensibilitatea la fotodaune, capacitatea de etichetare, grosimea probei și fluorescența de fundal sau fluorescența autologă a celulei. Cum funcționează Diversele microscoape de super-rezoluție funcționează în moduri diferite. În cazul PALM și STORM, doar o mică parte din markerii fluorescenți sunt excitați sau fotoactivați la un moment dat, permițând localizarea lor independentă cu mare precizie. Trecerea prin acest proces cu toate etichetele fluorescente are ca rezultat o imagine completă de super-rezoluție.
Stefan Hell, unul dintre câștigătorii Premiului Nobel pentru Chimie 2014 și director al Institutului de Chimie Biofizică Max Planck, a declarat: „Sistemul PALM/STORM este relativ ușor de instalat, dar este dificil de aplicat, deoarece fluorescentul grupul trebuie să aibă capacitatea de fotoactivare. Limitări Dezavantajul este că trebuie să detecteze o singură moleculă fluorescentă în contextul unei celule și sunt mai puțin fiabile decât STED." STED folosește un impuls laser pentru a excita fluoroforul și un laser în formă de inel pentru a stinge fluoroforul, lăsând doar fluorescența intermediară de mărime nanometrică pentru super-rezoluție. Scanarea întregului eșantion produce o imagine. „Avantajul STED este că este o tehnologie cu buton”, a explicat Hell. „Funcționează ca un microscop cu fluorescență confocal standard”. De asemenea, poate imaginea celulele vii folosind fluorofori, cum ar fi proteinele fluorescente verzi sau galbene și coloranții derivați de rodamină. Comparație parametrică Deși toate tehnicile de super-rezoluție depășesc microscopia luminoasă convențională în ceea ce privește rezoluția, ele diferă unele de altele. SIM dublează aproximativ rezoluția la aproximativ 100 nm. PALM și STORM pot rezolva ținte de 15 nm. Potrivit Hell, STED oferă o rezoluție spațială de 30 nm în celulele vii și 15 nm în celulele fixe. Când vine vorba de aplicații specifice, trebuie să luăm în considerare și raportul semnal-zgomot.
În unele cazuri, rezoluția mai mică, dar SNR mai mare poate duce la o imagine mai bună decât opusul (rezoluție mai mare, dar SNR mai scăzut). Viteza de achizitie a imaginii este de asemenea foarte importanta, mai ales pentru celulele vii. „Toate tehnicile de super-rezoluție sunt mai lente decât tehnicile convenționale de imagistică prin fluorescență”, a spus Stracy. „PALM/STORM este cel mai lent, are nevoie de zeci de mii de cadre pentru a obține o singură imagine, SIM are nevoie de zeci de cadre, iar STED este o tehnologie de scanare, deci viteza de achiziție depinde de mărimea câmpului vizual”. Pe lângă celulele vii sau celulele Imaging fixe, unii oameni de știință doresc, de asemenea, să înțeleagă cum se mișcă obiectele. Stracy este interesat să înțeleagă dinamica sistemelor biologice din celulele vii, nu doar imaginile statice. El combină PALM cu urmărirea unei singure particule pentru a analiza dinamica celulelor vii. În acest fel, el poate urmări direct moleculele marker pe măsură ce își îndeplinesc funcțiile. Cu toate acestea, el consideră că SIM nu este potrivit pentru studierea acestor procese dinamice la nivel molecular, dar datorită vitezei sale rapide de achiziție, este deosebit de potrivit pentru observarea dinamicii structurilor mai mari, cum ar fi cromozomi întregi.
Cele mai recente rezultate În 2017, echipa Hell's a raportat microscopul de super-rezoluție MINFLUX în Știință. Potrivit Hell, această metodă de super-rezoluție atinge o rezoluție spațială de 1 nm pentru prima dată. În plus, poate urmări moleculele individuale din celulele vii de cel puțin 100 de ori mai rapid decât alte metode. Alți oameni de știință au apreciat, de asemenea, microscopul MINFLUX. „Noi aplicații și abordări sunt în curs de dezvoltare, dar două progrese ies în evidență pentru mine”, a spus Shechtman. Unul este MINFLUX. „Folosește o abordare ingenioasă pentru a obține o poziționare moleculară foarte precisă”. În ceea ce privește a doua dezvoltare interesantă, Shechtman a menționat WE Moerner și colegii săi de la Universitatea Stanford. Moerner a fost și laureatul Premiului Nobel pentru Chimie în 2014. Unul dintre câștigători. Pentru a aborda limitarea rezoluției imagistice cauzată de împrăștierea anizotropă a moleculelor unice fluorescente, oamenii de știință au folosit polarizări de excitație diferite pentru a determina orientarea și poziția moleculelor. În plus, au dezvoltat suprafețe delicate ale pupilei. Aceste tehnici îmbunătățesc capacitatea de a localiza structuri. Despre etichetele fluorescente În multe aplicații de super-rezoluție, etichetele contează cu adevărat. Există și unele companii care furnizează produse conexe.
De exemplu, compania germană Miltenyi a făcut echipă cu Abberior, o companie fondată de Stefan Hell, pentru a oferi servicii personalizate de conjugare a anticorpilor pentru coloranții de microscopie de super-rezoluție. O serie de alte companii oferă, de asemenea, markere potrivite. „Nano-Boosterele noastre sunt foarte mici, doar 1,5 kDa și foarte specifice”, spune Christoph Eckert, ofițer de marketing la ChromoTek. Aceste proteine leagă proteinele fluorescente verzi și roșii (GFP și RFP). Acestea sunt derivate din fragmente de anticorpi de alpaca, cunoscute sub numele de VHH sau nanocorpi, cu proprietăți de legare excelente și calitate stabilă, fără variații de la lot la lot. Acești markeri sunt potriviti pentru diferite tehnici de super-rezoluție, inclusiv SIM, PALM, STORM și STED. Ai-Hui Tang, profesor asistent la Facultatea de Medicină de la Universitatea din Maryland, și colegii săi au folosit GFP-Booster și STORM de la ChromoTek pentru a explora propagarea informațiilor în sistemul nervos. Ei au descoperit nanoclustere moleculare, numite nanocoloane, în neuronii presinaptici și postsinaptici. Oamenii de știință cred că această structură arată că sistemul nervos central folosește principii simple pentru a menține și regla eficiența sinaptică. Diverse versiuni de imagistică de super-rezoluție și un număr tot mai mare de metode îi duc pe oamenii de știință și mai adânc în misterele biologice. Depășind limita de difracție a luminii vizibile, biologii pot chiar „monitoriza îndeaproape” acțiunile celulelor.
